6氨基移换反应及其产物的鉴定

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1、溯戸乂唆实验报告课程名称：生物化学实验（中）指导老师：杨劲树成绩:同组学生姓名：二、实验内容和原理四、实验方法和步骤六、实验结果和分析一、实验目的和要求三、实验材料和主要仪器五、实验数据记录和处理七、实验讨论和心得一、实验目的和要求1、学习鉴定氨基移换反应的简便方法及英原理；2、学习纸层析的原理和操作技术。二、实验内容和原理1.氨基移换反应：在氨基移换酶（转氨酶）的催化下，氨基酸的a■氨基和a■酮酸的a■酮基之间发生的互换反应。转氨酶的种类很多，任何一种氨基酸进行转氨作用时都由其专一的转氨酶催化。转氨酶的最适pH接近7.4,在各种转

2、氨酶中，谷丙转氨酶（GPT）和谷草转氨酶（GOT）的活性最强。转氨酶广泛存在于机体的各种组织中。在肝、心、肾等组织中谷丙转氨酶（GPT）、谷草转氨酶（GOT）活性较高。线GPT催化下的转氨基反应为：COOHCOOHCOOHCOOH1H一C——H2+1(_GPT1二C——O+H-I1丫NH2v1ch5(C严）2ch3(CH2)2C；OOHCOOH丙氨酸，酮戊二酸丙酮酸谷氨酸L—谷氨酸脱氢酶在体内特别是在肝细胞内含量丰富，活性高，催化L—谷氨酸氧化脱一NH2,加碘乙酸能抑制其活性，从而可以保护氨基移换反应的产物L—谷氨酸。本实验用纸层析

3、法，检查由丙氨酸和Q—酮戊二酸在肝细胞谷丙转氨酶（GPT）的作用下所生成的谷氨酸，证明组织内的氨基移换作用。2.纸层析原理：滤纸层析是以滤纸作为惰性支持物的分配层析。利用不同物质在两个互不相溶的溶剂中分配情况（溶解度）的不同来分离混合物的一种技术。层析溶剂是由有机溶剂和水组成。滤纸纤维上疑基具有亲水性，因此吸附一层水作为固定相，而通常把有机溶剂作为流动相。进行分离时，由于被分离物质的组分在两相中的分布不同，随着流动相的移动，物质将在两相间进行连续的、动态的不断分配，从而造成不同组分移动的速度也不相同。易溶于流动相中的组分移动快，在固

4、定相中溶解度大的组分移动慢，于是得到分离。实验名称：姓名：学号：Rf=X/Y在一定的条件下某种物质的Rf值是常数。Rf值的大小与样品的性质、结构、溶剂系统（溶剂的性质、溶剂的pH）、层析的温度和层析滤纸有关。此外，样品屮的盐分，其他杂质以及点样过多皆会影响样品的有效分离。用滤纸层析法分离氨基酸，是根据氨基酸样品的R基团的化学结构或极性大小的不同，将样品氨基酸溶解在适当的溶剂（0.01mol/LpH7.4磷酸缓冲液）中，点样在滤纸的一端，再选用适当的溶剂系统（酚溶液），通过毛细现象向另一端展层，展层完毕后，用苗三酮作为显色剂，即可得到

5、氨基酸样品的分离图谱。△1.苗三酮的显色原理：氨基酸+前三酮类T紫红红色复合80°C装必•幺MCtpVH订O一厂竺■晒w线°aqo°o所呈现的颜色随反应的条件（酸度、温度、盐浓度、铜、镉离子等）不同而异，本实验中其颜色的深浅•主要与谷氨酸/丙氨酸的浓度有关。三、实验材料和主要仪器1、实验材料：动物肝脏（牛蛙肝或猪肝）2、实验试剂：⑴O.（）lmol/L磷酸缓冲液（pH7.4）（转氨基反应所需缓冲溶液）；⑵O.lmol/La-丙氨酸（pH7.4）（转氨基反应的底物，纸层析的标准样品）；⑶0」mol/La—酮戊二酸（pH7.4）（转氨基

6、反应的底物）；⑷O.lmol/L谷氨酸（pH7.4）（纸层析的标准样品）；⑸展层溶剂一酚溶液：水饱和酚：冰乙酸（300：1）（纸层析用）；⑹1（）%三氯乙酸（终止酶促反应，使转氨酶及其它蛋白质变性、沉淀）；⑺0.25%碘乙酸（抑制L—谷氨酸脱氢酶活性）；⑻显色剂（0.1%苗三酮-乙醇溶液）。3、实验仪器（1）研钵；⑵试管及试管架；⑶恒温水浴箱（37°C、100°C）；⑷铅笔、尺和圆规；⑸毛细管（直径0.5mm）；⑹新华定性滤纸（直径11cm）；⑺剪刀和铁子；⑻电吹风；⑼滴管；（10）康氏皿;01）喷雾器。四、实验方法和步骤1、转氨酶

7、液的制备取新鲜牛蛙肝或猪肝约3g,剪碎用研钵将肝脏碾碎，加3ml磷酸缓冲液迅速碾磨，加9ml磷酸缓冲液，用两层纱布过滤，收集浆液或滤液即得转氨酶提取液备用。2、氨基移换反应取4支洁净、干燥的试管，按表1操作管号操作123林気海烫取浚（B1）11110.25MR乙(B1)Q50.50.50.5満加10%三氯乙100*CX5nin水浴保sg5ndnaIboI/L0-MKPH7.4

8、min（经箒搐动）滴加10%三氯乙敞藩掖2漓.V1“—1：…：.3、层析⑴准备：①取新华定性滤纸（直径11cm）一张，找出圆心，用圆规画一直径2cm的细圆圈（保持干净），并按图1用铅笔作出点样位置。找出圆心，用铅笔尖在圆心处截一小孔（