高效液相色谱法原理课件.ppt

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1、任务5高效液相色谱法分离原理液相色谱分析法模块之理解已知分析方法中采用的色谱类型能够正确解释色谱分离过程能够根据组分性质选择合适的色谱类型能力目标课程引入归一化法测定分析纯甲苯试剂的纯度色谱柱:4.6mm×150mm固定相:十八烷基硅烷键合相(ODS)流动相:水:甲醇=15:85外标法测定叶酸片中叶酸的含量色谱柱:4.6mm×250mm固定相:十八烷基硅烷键合相(ODS)流动相:磷酸二氢钠缓冲液:甲醇=80:20液相色谱是如何完成混合物的分离？课程引入混合物中各组分在固定相和流动相之间会发生吸附、溶解或其他亲和作用，这种作用存

2、在差异，从而使各组分在色谱柱中的迁移速度不同得到分离石油醚碳酸钙颗粒色素玻璃柱液液分配色谱法实例：归一化法测定分析纯甲苯试剂的纯度色谱柱:4.6mm×150mm固定相:十八烷基硅烷键合相(ODS)流动相:水:甲醇=15:85液液分配色谱液液分配色谱法固定相将特定的液态物质涂于担体表面化学键合于担体表面而形成的有机键合层如C18（十八烷基硅烷）、C8（辛烷基）、氨基键合硅胶固定相类型极性固定相：正相色谱以极性有机基团如胺基（-NH2）、腈基（-CN）、醚基（-O-）等键合在硅胶表面制成的非极性固定相：反相色谱反相色谱法最常用的固定

3、相是C18、C8和苯基键合相的填料，在分离极性很大的化合物时，也可以采用氨基、氰基等极性基团键合固定相。液液分配色谱使用条件为控制样品在分析过程的解离，常用缓冲液控制流动相的pH值，但需要注意的是，C18和C8使用的pH值通常为2.5~7.5（2~8）。太高的pH值会使硅胶溶解，太低的pH值会使键合的烷基脱落。键合相色谱—固定相特点使用过程中不流失均一性和化学稳定性好重现性好分离效率高适于梯度洗脱传质阻抗小反相色谱常见流动相流动相洗脱强度顺序：水<甲醇<乙腈<乙醇<四氢呋喃<丙醇<二氯甲烷（与水不混溶）若采用含一定比例的甲醇或乙

4、腈的水溶液作流动相，可用于分离极性化合物若采用水和无机盐的缓冲液为流动相，则可分离一些易离解的样品，如有机酸、有机碱、酚类等常见固定相反相色谱法最常用的固定相是C18、C8和苯基键合相的填料，在分离极性很大的化合物时，也可以采用氨基、氰基等极性基团键合固定相。键合相色谱—流动相疏溶剂理论：当溶质分子进入极性流动相后,即占据流动相中相应的空间，而排挤一部分溶剂分子；当溶质分子被流动相推动和固定相接触时，溶质分子的非极性部分或非极性分子）会将非极性固定相上附着的溶剂膜排挤开，直接和非极性固定相上的烷基官能团相结合（吸附）形成缔合物，

5、构成单分子吸附层；当流动相极性减小时，这种疏溶剂斥力下降，会发生解缔，并把溶质分子释放而被洗脱下来反相色谱法的分离机理1影响溶质保留的三个主要因素：溶质分子中非极性部分的总表面积溶质和固定相接触的总表面积愈大，保留值愈大，所以溶质的极性愈弱，疏水性越强，保留值越大。键合相上的烷基总面积烷基键合固定相的作用在于提供非极性的作用表面。随着碳链的加长，烷基的疏水特性增强，溶质的保留值也随烷基碳链长度的增加而增大。流动相的表面张力流动相的表面张力愈大，介电常数愈大，极性亦愈强；溶质和烷基键合相的缔合作用愈强，流动相的洗脱强度弱，导致溶质

6、的保留值大。反相键合相色谱法的分离机理2时间，min固定相：C1固定相：C8固定相：C181-尿嘧啶；2-苯酚；3-乙酰苯；4-硝基苯；5-苯甲酸甲酯；6-甲苯例：反相键合色谱中，键合相碳链越长，分离效果越好。分离机理实例正相色谱法反相色谱法1.极性固定相聚乙二醇、氨基与腈基键合相2.相对非极性流动相正已烷、环已烷3.极性调节剂乙醇、四氢呋喃、三氯甲烷4.分离中等极性和极性较强化合物.酚类、胺类、羰基类及氨基酸类5.组分流出顺序极性小先洗出1.非极性固定相C18（简称ODS）、C82.极性流动相水或缓冲液3.极性调节剂甲醇、乙腈

7、、四氢呋喃4.分离非极性和极性较弱化合物占整个HPLC应用的80%左右5.组分流出顺序极性大先洗出液液分配色谱其他类型色谱法按分离机制分类：液固吸附色谱法离子色谱法凝胶色谱法（分子排阻色谱法）（空间排阻色谱法）其他类型色谱法氯化噻吩嗪四种异构体的分离色谱图氯化噻吩嗪四种异构体的分离异构体具有不同的空间排列方式，因此吸附剂对它们的吸附能力有所不同，从而得到了分离。液固吸附色谱实例液固吸附色谱法固定相：吸附剂为硅胶或氧化铝，粒度5-10μm流动相：有机溶剂适用于分离分子量200-1000的组分，大多数用于非离子型化合物的分离，常用于

8、分离同分异构体。液固吸附色谱各组分的出峰顺序极性较小组分，吸附力较弱，容易解吸，先流出。极性较大组分滞留作用大，后流出。饱和烃<烯<芳烃<醚<醛酮<酸吸附脱附再吸附再脱附…分离过程是一个吸附－脱附的平衡过程。液固吸附色谱法分离机理液固吸附色谱分离机理离子交换色谱