采用多重PCR结合高分辨熔解曲线法单管同时检测JAK2V617F突变和JAK2外显子12突变.pdf

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1、194·中华检验医学杂志2014年3月第37卷第3期ChinJLabMed，March2014，Vo1．37，No．3．论著采用多重PCR结合高分辨熔解曲线法单管同时检测JAV617F突变和JAK2外显子12突变许笑陈宇明吴之源张心菊胡婷婷张瑾关明【摘要】目的建立能单管同时检测JAK2V617F突变和外显子12突变的方法。方法以Pc一3细胞株DNA为野生型对照，分别以HEL细胞株DNA和含有JAK2外显子12突变的质粒作为JAK2V617F突变和外显子12突变的阳性对照，采用多重PCR扩增不同DNA片段，并结合高分辨熔解

2、曲线法建立检测JAK2V617F和外显子12突变的联合检测体系。同时选取42例真性红细胞增多症患者，分别采用上述方法和常规方法在外周血中检测JAK2的2种突变。结果采用多重PCR结合高分辨熔解曲线法成功建立了JAK2突变联合检测体系，能够同时检测JAK2V617F突变和外显子12突变，2种突变的检测灵敏度皆可达5％，2种扩增片段的溶解温度(Tm)的批间及批内变异系数都小于0．01％。42例真性红细胞增多症患者中，发现37例携有JAK2V617F突变，在5例JAK2V617F突变阴性真性红细胞增多症病例中检出2例JAK2外

3、显子12突变。与常规方法相比，结果符合率达到100％。2例JAK2外显子12突变经克隆测序确认突变类型为H538K539delinsL和F537-1546du110+F547L。结论该方法可同时在外周血中检测出JAK2的2种突变，将有助于对骨髓增殖性肿瘤尤其是真性红细胞增多症的分子诊断。r中华检验医学杂岳，2014，37：194—197)【关键词】Janus激酶2；外显子；突变；多重聚合酶链反应；高分辨率熔解曲线；红细胞增多症，真性SimultaneousdetectionofJAK2V617FmutationandJA

4、K2exonl2mutationsbymultiplexPCRandhigh-resolutionmeltingcurveanalysisXuXiao，ChenYuming，耽Zhiyuan，ZhangXinju，HuTingting，Zhangfin，GuanCentralLaboratoryofHuashanHospital，FudanUniversity，Shangha20O0．inaCorrespondingauthor：Guan，Email：guanming88@yahoo．com【Abstract】Objec

5、tiveToestablishasingle—tubedetectingsystemforthesimultaneousidentificationofJAK2V617FandJAK2exonl2mutations．MethodsGenomicDNAofcelllinePC一3wasutilizedasthewildtypecontro1．whilegenomicDNAofcelllineHELandplasmidswithdiverseJAK2exon12mutationswereusedasthepositiveco

6、ntrolsforJAK2V617Fandexonl2mutations．MuhiplexPCRwasperformedtoamplifythedifferentampliconscombinedwithhigh—resolutionmelting(HRM)analysis，whichestablishedthemultiplexdetectingsystemforJAK2V617Fandexonl2mutations．Meanwhile42casesofpolycythemiaverapatientswerecolle

7、ctedtodetect2kindsofJAI(2mutationsbytheabovesystemandroutinemethods．ResultsThemultiplexJAK2mutationsdetectingsystemwassuccessfullyestablishedbymultiplexPCRcombinedwithhigh—resolutionmeltingcurveanalysis，whichcouldsimultaneouslydetectJAK2V617FandJAK2exonl2mutation

8、s．Theanalyticalsensitivitiesof2mutationsinthissystemwerebothupto5％andtheprecision(eoemeientofvariation)ofintra—andinter—assayofthemeltingtemperature(Tm)of2ampl