应用高分辨熔解曲线系统检测髓系肿瘤中基因突变及其临床意义

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1、江苏大学博士学位论文应用高分辨熔解曲线系统检测髓系肿瘤中基因突变及其临床意义姓名：林江申请学位级别：博士专业：临床检验诊断学指导教师：许文荣20120608江苏大学博士学位论文摘要1．研究目的(1)应用高分辨熔解曲线分析(HRMA)技术建立髓系肿瘤中相关基因(C．KIT、IDHl、IDH2、DNMT3A、U2AFl和JA怼)突变的分子诊断平台。(2)探讨这些基因突变的临床意义。2．研究方法(1)临床病例收集、细胞分离及DNA提取：收集按FAB和WHO标准诊断的初诊急性髓系白血病(AML)221N、骨髓增生异常综合征(MDS)88例和骨髓增殖性肿瘤(MPN)142

2、例骨髓标本，用人淋巴细胞分离液(Ficoll—Hypaque)分离骨髓单个核细胞，DNA抽提试剂盒提取基因组DNA。(2)PCR扩增：针对不同基因(包括C．KIT、IDHI、IDH2、DNMT3A、U2AFl和JAK2)的基因突变位点建立相应的PCR扩增反应体系，在ABI7300PCR扩增仪上分别对这些基因进行扩增。(3)HRMA检测：将PCR扩增产物在LightScanner分析仪上进行荧光扫描，应用分析软件进行处理，分析HRMA检测不同基因突变的灵敏度，并进一步检测待测标本的基因突变情况。“)DNA测序：首先评估DNA测序检测不同基因突变的灵敏度，然后对HR

3、MA扫描鉴定为突变的标本进行测序。(5)突变的临床意义分析：Spearman秩和相关检验进行突变与性别、年龄、血液学参数、染色体分组、FAB分型、WHO分型等的相关性分析；应用卡方检验或Fisher确切检验对突变阳性组和阴性组之间的应用高分辨熔解曲线系统检测髓系肿瘤中基因突变及其临床意义分类变量(如性别、染色体分组、FAB分型和WHO分型等)进行差异性比较，应用Mann-Whitney嘴验对突变阳性组和阴性组之间的连续变量(如年龄和血液学参数等)进行差异性比较。应用Kaplan-Meier和Cox分析分别对生存时间进行单因素和多因素分析。3．研究结果(1)C-K

4、IT突变：①HRMA检测C．KIT突变的灵敏度达5％，高于DNA浈I]序的灵敏度(10％)；②对160例AML患者进行检测发现9例(6％)存在C．KIT基因突变，进一步测序证实4例为D816V突变、4例为N822K突变、l例为D816H和N822K双位点突变；9例C．KIT突变主要发生于FAB．M2亚型，其中7例患者伴有t(8；21)易位，2例患者为正常核型。在25例t(8；21)易位AML患者中，C．KIT突变发生率为28％，突变者与非突变者比较，两组在性别、年龄、血象方面并无差异。(2)IDHI／IDH2突变：①HRMA检测IDHIR132H、IDH2R14

5、0Q和IDH2R172K突变的灵敏度分别为5％、2％和5％，均高于DNAi贝q序的灵敏度(10％)：②对198例AML患者的进一步检测发现IDHl和IDH2突变发生率分别为2．O％(4例)和5．O％(10例)，均为杂合性突变、且均为单独发生。IDHl突变包括3例R132H和l例R132S突变，IDH2突变包括7例R140Q和3例R172K突变。伴IDHI／IDH2突变的AML患者年龄明显高于无突变者(P=-0．002)。两组患者在性别、血细胞计数和FAB分型方面并无统计学差异(尸>O．05)。染色体核型正常的AML患者中IDHIflDH2突变率(12／85，14

6、．1％)明显高于核型异常患者(2／99，2．O％)(P=0．004)。③82例MDS患者分别检出2例(2．4％)和3例(3．6％)存在IDHl(R132HStlRl32S各1例)和IDH2突变(均为R140Q)。IDHI和IDH2突变均为杂合性、且均为单独发生。伴或不伴IDHIflDH2突变者在性别、年龄、血红蛋白含量和血小板计数方面并无显著性差异汀苏大学博上学位论文(尸>O．05)，但伴突变者的白细胞计数明显高于无突变者(卢0．010)。虽然全部突变均见于核型良好组，但并无统计学意义(卢O．407)。正常核型患者IDHl／IDH2突变率(5／52，9．6％)高

7、于异常核型患者(0／30，0％)(P=-0．153)。此外，根据IPSS分组，所有IDH突变均发生于低危组或中危．1组患者。多变量Cox分析揭示年龄和IPSS分组是MDS患者独立的预后因素，而IDHl／IDH2突变对生存时间并无影响。④85例慢性髓系白血病(CML)和57例Ph．MPN患者中均未检测出IDHl／IDH2突变。(3)DNMT3A突变：①HRMA检测DNMT3AR882H突变的灵敏度为2％，高于DNA测序的灵敏度(10％)；②182例AML患者中12例(6．6％)检出DNMT3A突变，均为杂合性突变，包括8例R882H、3NR882C和l例R882P

8、。R882突变与患者的性