度夏仿刺参病原菌伯麦罗氏弧菌的分离鉴定和特征研究.pdf

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1、第53卷第2期厦门大学学报(自然科学版)Vo1．53No．22014年3月JournalofXiamenUniversity(NaturalScience)Mar．2O14度夏仿刺参病原菌伯麦罗氏弧茵的分离鉴定和特征研究方旅平，周宸，黄瑞芳。，林琪，何丽斌，葛辉，李少菁(1．厦门大学海洋与地球学院，福建厦门361102；2．福建省水产研究所，福建厦门361013)摘要：以患有腐皮综合征的度夏仿刺参(Apostichopusjaponicus)为对象，从其体壁病灶处分离纯化获得一株病原细菌．通过传统细菌鉴定方法对病原菌的形

2、态学、生理生化特征和培养特征进行研究；以16SrRNA基因测序为基础，结合基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术(MALDI-TOFMS)进行鉴定，结果表明该菌株在分类上属于伯麦罗氏弧菌(Vibriopomeroyi)；人工感染实验验证了不论是注射感染还是浸浴感染，该菌株均能导致仿刺参发病甚至死亡．此外，将本次实验获得的伯麦罗氏弧菌菌株SUS(V．pomeroyiSUS)与伯麦罗氏弧菌的其他菌株，如pomeroyiLMG20537(典型菌株)、pomeroyi929进行比较，探讨了来自不同海域的菌株生理生化特征与环境因子之

3、间的关系．研究结果显示：伯麦罗氏弧菌为南移度夏仿刺参腐皮综合征的病原菌，而且表明MALDI-TOFMS技术结合微生物数据库MALDIBiotyper系统的鉴定方法准确、便捷、重复性高，非常适合于传统鉴定方法易混淆的种类鉴别，这为南移仿刺参的疾病检查和预防奠定了基础．关键词：伯麦罗氏弧菌；仿刺参；腐皮综合征；16SrRNA；MALDI-TOFMS中图分类号：S941．42文献标志码：A文章编号：0438—0479(2014)02—0273—10仿刺参[Apostichopusjaponicus(Selenka，合群中已有种

4、类被报道会引起海洋生物发病甚至死1867)]隶属于棘皮动物f-／(Echinodermata)海参纲亡[a-s3．这一复合群中的弧菌其系统发育特征较为接(Holothuroidea)檐手目(Aspidochirotida)仿刺参科近，而传统的生化实验又耗时费力，因而如果能利用(Stichopodidae)仿刺参属(Apostichopus)，是我国重基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术(matrix-要的海洋养殖对象．仿刺参为温带种，因此仿刺参度夏assistedlaserdesorption／ionizationtim

5、eofflight是南移养殖的关键问题，当进入夏季后南方海域的水massspectrometry，MALDI—TOFMS)，将为海洋水温高于2O℃时，仿刺参易于被海洋环境微生物所感产动物病原菌的鉴定提供更为便捷、准确的鉴定方法．染而患病，其中最常见的疾病是腐皮综合征，如MALDI—TOFMS技术已在我国医学领域内用于快速2008-2011年福建省养殖仿刺参发生腐皮综合征，虽鉴定病原菌，得到了很好的结果]，但是在水产养殖然未出现大规模死亡，但是这种疾病严重威胁着南方动物的病原微生物检测上还很少被使用，仅有零星报仿刺参养殖业

6、持续、稳定、健康发展．道[73．本研究将运用该技术对分离自仿刺参的病原菌弧菌(Vibrio)在海洋环境中是普遍存在的，会以进行鉴定，使该技术能在水产养殖动物病原菌的鉴定相当高的密度出现在海洋生物的体内或体表，包括珊领域内得到更好的推广．瑚、鱼类、贝类、头足类、海绵、虾类和浮游动物等[1]．本文围绕南移仿刺参度夏期间腐皮综合征的病目前，包括灿烂弧菌(V．splendidus)、塔斯玛尼弧菌原菌的致病性、生理生化特征、16SrRNA基因序列和(、，r．tasmaniensis)、伯麦罗氏弧菌(．pomeroyi)等8蛋白质谱

7、分析等方面进行了研究，为南移养殖仿刺参个在系统发生上与灿烂弧菌相近的种类被合称为灿的病原检测提供了新方法，并为仿刺参南移养殖地区烂弧菌复合群(．splendidus—likecomplex)Ezg，此复的病害防治奠定基础．1材料与方法：基金项目导阡科研专币阉潍浦科2012)003县、1．1实验材料：福建省海洋与渔业厅科研专项(闽海渔科(号)一丑’。，J11*通信作者：zoopecol@xmu．edu．cn2008和2009年的夏季福建省养殖仿刺参均发生厦门大学学报(自然科学版)了腐皮综合征．2009年8月，自福建莆田的养

8、殖池中在浸浴实验中，水体中的菌落终浓度分别为3．【J采集患病仿刺参，同时用于人工感染的健康仿刺参也×10和3．0×10CFU／mL．实验仿刺参的数量和分同样采购于莆田．采集的样品体质量为5～10g。患病组情况同上，并观察记录仿刺参发病症状和死亡情况．仿刺参每个个体均进行观察并拍照．将记录的每日死亡仿刺参数量用Grap