脂质组学血清样品处理方法及其快速高分辨液相色谱-质谱分析.pdf

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1、第41卷分析化学(FENXIHUAXUE)研究报告第9期2013年9月ChineseJournalofAnalyticalChemistry1308～1314DOI：10．3724／SP．J．1096．2013．21231脂质组学血清样品处理方法及其快速高分辨液相色谱一质谱分析习聪陈艳华杨维张瑞萍贺玖明张化冰肖新华再帕尔·阿不力孜(中国医学科学院／JL京协和医学院药物研究所，天然药物活性物质与功能国家重点实验室，北京100050)(中国医学科学院／北京协和医学院北京协和医院，北京100730)摘要通过系统

2、考察血清样本前处理方法、优化液相色谱条件及质谱检测参数，建立了脂质组学血清样本前处理及其快速高分辨液相色谱一质谱(RRLC—MS)分析方法。血清样本中加入二氯甲烷一甲醇(CH：C1一CHOH，2：1，v／v)混合溶剂进行脂质提取，采用ACQUITYUPLCCSHCl8色谱柱(100mm×2．1mm，1．7m)，以10mmol／L甲酸铵溶液(含0．1％甲酸)为流动相A，乙腈一异丙醇(1：1，V／V)为流动相B，梯度洗脱，采用正负离子检测模式电喷雾电离(±)ESI、正离子检测模式大气压化学电离(+)APCI方

3、式进行质谱检测。对血清中脂肪酸、甘油脂、鞘磷脂、甘油磷脂和胆固醇(酯)5类14种代表性脂质类成分进行了方法学考察。结果表明，方法灵敏度高、精密度及稳定性良好。对穿插在检测序列中的质控样本检测结果进行主成分分析(PCA)，证明了本方法获得数据的可靠性良好，适用于脂质组学研究。关键词脂质组学；血清前处理方法；液相色谱一质谱1引言随着20世纪系统生物学的兴起，在代谢组学的基础上，2003年脂质组学研究正式被提出¨，并被应用于疾病诊断、药物开发等领域的研究J。在脂质组学研究中，从生物样本中提取脂质类成分的完整性对

4、脂质组学分析方法有非常重要的意义。传统“金标准”法即“Folchorblighanddyerrecipes”法(采用CHC1一CHOH(2：1，v／v)混合溶剂)是目前最常用的脂质类成分提取方法。然而氯仿具有致癌性l6j，且氯仿降解后产生光气、氯化氢气体，可能使不稳定的脂质类成分发生化学修饰，影响脂质组学分析测定的准确性。目前文献报道了改进的二氯甲烷．甲醇(CHC1-CHOH)提取法和甲基叔丁基醚．甲醇(MTBE．CHOH)提取法_9以及两种方法分别与金标准方法的对比研究。但是未见对3种提取方法的系统比较

5、，文献报道的脂质组学分析方法中未见关于样本稳定性的考察研究’’”J。本研究采用(-4-)ESI、(+)APCI相结合的RRLC—MS技术，可以获得含有更全面质谱信息的脂质组学数据。选取血清中l4种代表性脂质类成分，系统考察了脂质类成分的提取方法，并对分析过程中涉及到的处理前、处理过程中及处理后的血清样本在不同放置条件及存放时间进行稳定性考察与验证，旨在排除外界因素对测定结果的影响，保证分析结果的客观性¨。2实验部分2．1仪器与试剂Agilent1200系列快速高分辨液相色谱仪(德国WaldbronnAgl

6、ienttechnologies公司)；QTRAP删5500型四极杆．线性离子阱串联质谱仪(美国AppliedBiosystems／MDSSCIEX公司)，配有ESI源、APCI源及Analyst1．5．1数据处理系统。脂质类成分标准品的信息见表l(依据网站LipidMaps(http：／／www．1ipidmaps．org)命名)，甲酸铵(色谱纯)均购自美国Sigma—Aldric公司。乙腈、异丙醇和甲酸(色谱纯，Merck公司)。实验用水为某品牌纯净水。2012—12-07收稿；2013-04—17接

7、受本文系教育部创新团队项目(No．IRT1007)资助E—mail：rpzhang@imm．ac．cn第9期习聪等：脂质组学血清样品处理方法及其快速高分辨液相色谱一质谱分析1309人血清样本采自北京协和医院(符合中国医学科学院伦理学委员会要求)，采集后立即于一80℃冷冻保存。2．2色谱-质谱条件ACQUITYCSHC】8色谱柱(100ram~2．1mm，1．7m；美国Waters公司)，流动相：A为10mmol／L甲酸铵溶液(含0．1％甲酸)；B为乙腈一异丙醇(CH，CN．IPA，1：1，)混合溶液。线性

8、梯度洗脱条件：0—20min，70％～100％B，20～40min，100％B，平衡时间20min。流速：250L／min。柱温：35oC；进样量：5L。ESI离子源喷雾电压5kv／_4．5kV，APCI离子源放电电流3A／_3A，解簇电压为8OV／__8OV，源温500oC，雾化气40，干燥气45，气帘气3O，扫描范围为350～1000Da(正离子模式)、100～1000Da(负离子模式)。数据采集和处理采用Analyst1