代谢组学血浆样品前处理及其快速高分辨液相色谱-质谱分析方法研究.pdf

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1、第39卷分析化学(FENXIHUAXUE)研究报告第12期2011年12月ChineseJournalofAnalyticalChemistry17931797代谢组学血浆样品前处理及其快速高分辨液相色谱一质谱分析方法研究徐婧田亚平陈艳华张瑞萍杨芬宋咏梅。再帕尔·阿不力孜¨(中国医学科学院，北京协和医学院药物研究所，北京100050)(中国医学科学院，北京协和医院，北京100032)(中国医学科学院，北京协和医学院肿瘤医院／研究所，北京100021)摘要采用快速高分辨液相色谱一质谱联用技术，对代谢组学研究中血浆样品的前处理方法进行了考

2、察及优化，建立了用于血浆中小分子代谢物分析的前处理方法。通过考察有机溶剂沉淀蛋白(不同溶剂系统)和固相萃取(Solidphaseextraction,SPE)两种方法对血浆中蛋白质去除程度及16个代表性化合物的提取效果，确定采用乙腈沉淀蛋白法；进一步对乙腈沉淀蛋白法进行了细致的优化，确定使用3倍体积的冷藏乙腈慢速沉淀可以达到最佳的处理效果。对血浆中1O种代表性化合物进行了方法学考察，结果表明，本方法重现性、精密度及样品冻融稳定性均良好。对穿插在检测序列中的生物质控样本检测结果进行主成分分析(Principalcomponentanal

3、ysis，PCA)，证明本方法在代谢组学研究中的可重复性及获得的数据的可靠性良好，适用于代谢组学研究。关键词代谢组学；血浆前处理方法；快速高分辨液相色谱一质谱联用技术1引言代谢组学是研究生物体内源性代谢物的整体及其变化规律的科学[1～，作为系统生物学的重要组成部分得到了迅速发展，并在制药、药物毒理等领域得到了成功应用。人体血浆作为代谢组学研究中的重要体液样本，其中含有2000多种内源性小分子代谢物，与常见的尿液样本相比，前处理过程相对复杂。首先，由于含有大量的蛋白质类成分，因此进行HPLC—MS分析前需要去除蛋白质；其次，由于血浆中所

4、含成分种类繁多、极性跨度很大，既有高极性的氨基酸、葡萄糖、核苷类等，也有低极性的脂类、固醇类等代谢物。代谢物成分的复杂性增加了血浆样品分析的难度与挑战”。本研究采用快速高分辨液相色谱一质谱联用技术(Rapidresolutionliquidchromatography—massspectrometry,RRLC—MS)技术，针对血浆样品前处理中常用的有机溶剂沉淀蛋白法与固相萃取方法进行了比较，并进行了方法优化及方法学考察；采用主成分分析(Principalcomponentanalysis，PCA)对穿插在检测序列中的质量控制(Qua

5、litycontrol，QC)样品数据进行统计分析，最终建立了适合于代谢组学研究的血浆样品前处理方法。2实验部分2．1仪器与试剂Agilent1200SeriesRRLCsystem(德国WaldbronnAglientTechnologies公司)；QTRAP四极杆一线性离子阱串联质谱仪(美国AppliedBiosystems／MDSSCIEX公司)，配有ESI源和AnalystQS1．5数据处理系统；乙腈、甲醇、乙醇、丙酮和甲酸(色谱纯，Merck公司)；标准品分别购自Fluka公司、Sigma-Aldrich公司及中国药品生物制

6、品检定所；实验用水为超纯水。人血浆样品(EDTA抗凝)，采自中国医学科学院北京协和医院，采集后立即于一80℃冷冻保存。2．2色谱条件ZorbaxAq-C18色谱柱(100ram~2．1mmX1．8gm；美国Agilent公司)；流动相：A为H20(含0．1％201卜04-14收稿；201卜06-24接受本文系国家重大科学研究计划(No．2006CB910600)项目E-mail：zeper@imm．ac．cn分析化学第39卷formicacid)；B为CH3CN。线性梯度洗脱：0～20min，0～100％B；20~23min，100％

7、B。每次进样前，色谱柱在初始流动相条件下平衡8min，流速250~L／min。柱温60℃；进样量5pL。2．3质谱条件ESI离子源，分别采用正、负离子EMS扫描模式，喷雾电压为5500~4500V，解簇电压(DP)为50～一50v，源温度375℃，雾化气为7．5MPa，干燥气为6．5MPa，气帘气为4．0MPa，扫描范围为65～850Da。数据采集和处理采用Analyst1．5数据处理系统。2．4标准品及样品的制备(1)标准品溶液1肌酐(Creatinine，Crea)、L一半胱氨酸(L—Cysteine，Cys)、L一异亮氨酸(L—

8、Isoleucine，Ile)、马尿酸(Hippuricacid，HA)、葡萄糖(Glucose，GI)、L～酪氨酸(L—Tyrosine，Tyr)、犬尿烯酸(Kynurenicacid，KA)、枸橼酸(Citricac