纳升液相色谱-高分辨串联质谱分析尿液多肽组及其翻译后修饰.pdf

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1、第44卷分析化学(FENXIHUAXUE)研究报告第5期2016年5月ChineseJournalofAnalyticalChemist~716～722DOI：10．11895／j．issn．0253-3820．150809纳升液相色谱-高分辨串联质谱分析尿液多肽组及其翻译后修饰洪晓愉李水明王勇(深圳大学生命与海洋科学学院，深圳市微生物基因工程重点实验室深圳市海洋生物资源与生态环境重点实验室，深圳518060)摘要多肽组是指生物体表达的所有多肽，尿液等体液的多肽组是生物标记物的重要来源。本研究采用氧化石墨烯一磷酸镧纳米磁性复合材料分离富集尿液多

2、肽，进行纳升液相色谱一高分辨串联质谱分析，从单一样本中鉴定了归属于123个蛋白质的790条肽段。研究表明，这些肽段在蛋白质水平上不是平均分布的。此外，本研究检测到了肽段的氧化、磷酸化和脱氨化等翻译后修饰现象，观察到了尿液多肽的阶梯序列性，从蛋白水平上对尿液多肽组进行了生物信息学分析，结果表明，这些多肽所归属的大部分蛋白质之间存在相互作用。本方法可为在尿液中寻找疾病的标志物提供方法学支持。关键词多肽组；纳升液相色谱一高分辨串联质谱；尿液；翻译后修饰1引言随着基因组学、转录组学和蛋白质组学在生命科学领域中的迅速发展，多肽组学的研究也逐渐引起人们的关

3、注。从最简单的腔肠动物到最高等脊椎动物中，大部分动物体内都存在多肽J。多肽组学的研究内容包括体液、组织和细胞等生物体内全部内源性多肽的组成、功能和变化规律。有些多肽作为蛋白质合成、加工、降解的产物J，可以反映机体内蛋白质的异常代谢过程。蛋白质被剪切成不同的肽段后还可发挥特定的功能。有些多肽作为生化信使分子，如多肽激素、神经多肽、细胞因子、酶抑制因子等，组织调控机体内很多生理生化过程，与疾病的产生有着密切的关系。作为蛋白质组学的延伸，多肽组学技术能很好地监测到低分子量蛋白质的变化。在疾病生物标志物的筛选、疾病诊断、疾病监测、疗效评价及预防等方面，

4、多肽组学也发挥了重要作用J。尿液作为机体代谢的终端，用于检测疾病的样本时具有可持续性和非侵袭性的优点J。表面增强激光解吸／电离飞行时间质谱仪(SELDI—TOFMS)、基质辅助激光解吸电离质谱(MAIDI—TOFMS或者MAIDI—TOF／TOFMS)以及ESI一串联质谱仪，例如三重四级杆质谱仪、离子阱或者四级杆飞行时间质谱仪都可对多肽进行检测和分析。利用MAIDI—TOFMS，研究者在胃癌、乳腺癌l】、膀胱癌¨，IgA肾病¨等的早期诊断研究中寻找到一些多肽生物标志物。但是此类方法在在寻找疾病差异多肽时，重点在于差异峰的比较，不能准确鉴定蛋白质

5、及其翻译后修饰。氧化石墨烯．磷酸镧纳米磁性复合材料(LaGM)是由石墨烯、LaPO纳米棒和Fe，0纳米粒子构成的三重复合材料，能够应用于低丰度多肽的快速富集，如可有效富集尿液中的多肽。本研究采用LaGM分离和富集尿液多肽，采用纳升液相色谱一串联高分辨飞行时间质谱仪鉴定多肽序列和翻译后修饰，1．5mL尿样单一样本中鉴定出归属于123种蛋白质的790条肽段，其中有91条肽段带有氧化、磷酸化和脱氨化翻译后修饰。本研究为利用尿液多肽组研究疾病生物标志物提供了快速高效的分析方法。2实验部分2．1仪器与试剂EksigentnanoLC—UltraTM2D二

6、维纳升液相色谱系统、TripleTOF5600高分辨质谱仪、ProteinPilot4．5软件(ABSCIEX，美国)；真空冷冻干燥机、超纯水仪(ThermoScientific，美国)；C反相色谱捕集柱2015—10．14收稿；2016~1-05接受本文系国家。自科学基金项目(No31470804)，深圳市重点项目(N。．JSGG20140703163838793)和深圳市基础科学布局项目阿尔茨．海默症临床诊断研究(No．基20150006)资助E．mail：wyong@SZU．edu．ell第5期洪晓愉等：纳升液相色谱一高分辨串联质谱分析尿

7、液多肽组及其翻译后修饰717(100p,m×3em，3m，150A，Eksigent，美国)；C8反相色谱分析柱(75m×15em，3m，120A，Eksigent美国)。LaGM按文献[13]方法自行制备；实验用水为超纯水；纳升反相色谱流动相A：98％水、0．1％甲酸和2％乙腈，纳升反相色谱流动相B：2％水、0．1％甲酸、98％乙腈。2．2多肽的分离和富集采集健康人尿液分装后于0℃保存。取1．5mL尿液样品，10000r／min离心10min后取上清液，按照尿液与30me,／mLLaGM复合材料体积比为50：1混合，充分涡旋2min后，以10

8、00r／min室温振荡10min；10000r／min离心5min，磁分离，弃上清液。在沉淀中加入500水，充分涡旋1min，室温振荡5min，100