诱导培养条件显著改变甘草愈伤组织次生代谢产物多样性.doc

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1、诱导培养条件显著改变甘草愈伤组织次生代谢产物多样性［摘要］采用化学分析和高效液相色谱（HPLC）相结合的方法评价典型愈伤组织诱导培养条件对甘草愈伤组织次生代谢产物多样性的影响，这些诱导培养条件包括甘草种属（胀果甘草和光果甘草）、外植体（胚轴和子叶）、光照条件（24h光照和24h黑暗）和2种激素组合。以化学成分总黄酮为指标，采用单因素方差分析法（One-wayANOVA）评价不同诱导培养条件下获得的甘草愈伤组织的总黄酮含量，结果显示甘草种属、外植体和光照条件对甘草愈伤组织中总黄酮的含量影响显著（P2.1不同诱导培

2、养条件对甘草愈伤组织总黄酮含量的影响为考察不同诱导培养条件对甘草愈伤组织总黄酮含量的影响，分别选取了一些典型的诱导条件包括甘草种属、外植体、光照条件和激素组合进行了5组试验，见表lo其中，处理组A和B,C和D,A和C,D和E分别考察2种甘草种属、光和暗条件、2种外植体、2种激素组合对甘草愈伤组织总黄酮含量的影响，结果见图lo在本研究中，采用甘草昔为对照品，以甘草昔的浓度C为横坐标，以吸光度A为纵坐标，测得甘草昔对照品的回归曲线为Y=0.0158X,R2=0.9991,实验表明对照品质量浓度在20〜100ug•L

3、-1与吸光度A呈良好的线性关系。检测栽培甘草根和甘草愈伤组织中总黄酮的含量，结果表明，5种诱导培养条件下获得的愈伤组织中总黄酮的质量分数为15〜60mg・g-1干重，比相同种属栽培甘草根中总黄酮的含量（GI为120mg•g-1干重，GG为55mg•gT干重）要低很多。相同培养条件下，不同种属的甘草诱导的愈伤组织中总黄酮的含量不同，胀果甘草诱导的愈伤组织（处理A）中总黄酮为25mg-g-1干重，高于光果甘草诱导的愈伤组织（处理B）中总黄酮的15mg•g-1干重；24h连续光照条件下诱导培养的愈伤组织（处理D）总黄

4、酮的质量分数（60mg•g-1干重）要远高于24h黑暗条件下（处理C）培养的愈伤组织总黄酮（20mg・gT干重），这与杨世海等［9］利用乌拉尔甘草下胚轴为外植体在白色光照（荧光灯连续照射）和黑暗（24h）培养愈伤组织进行有效成分分析时，得出的愈伤组织在光照条件下合成的黄酮类化合物的总量是黑暗条件下合成的化合物总量的2倍的结论一致。处理D,E的甘草愈伤组织中总黄酮含量都很高，但相差不大，见图1。在选取考察的5个诱导培养条件中，胀果甘草的子叶为外植体在光照下诱导时选取的这2个激素都比较适合进行甘草愈伤组织总黄酮的生

5、产。实验结果采用单因素方差分析法（One-WayANOVA）进行分析，甘草种属、外植体和光照条件对甘草愈伤组织中总黄酮的含量具有极其显著的影响，然而，激素组合对甘草愈伤组织中总黄酮的含量无显著影响，见表2O植物细胞中黄酮类化合物的合成受诱导培养条件的影响，这与杨世海等［10］以乌拉尔甘草胚轴为外植体，以不同类型的培养基、不同培养基pH、培养基中添加不同激素等条件诱导并培养甘草愈伤组织，得到的愈伤组织中黄酮类化合物的含量不同的结论一致。2.2甘草愈伤组织次生代谢产物的多样性的差异本文采用中药指纹图谱相似度评价系统

6、（2004,A版）通过比较愈伤组织样品HPLC图中的峰面积、峰数量计算HPLC图的相似度，从而获得其差异度。5种典型诱导培养条件下甘草愈伤组织的次生代谢产物的多样性组成的HPLC图。用7种甘草黄酮及三茹类化合物作为对照品检测诱导培养的甘草愈伤组织的化合物组成，结果显示活性次生代谢产物甘草昔［11］、异甘草昔、甘草素［12］、甘草查尔酮A［13］、甘草酸以及异甘草素［14］都存在于本实验中培养的甘草愈伤组织中，见图2。采用中药指纹图谱相似度评价系统计算不同诱导培养条件下的愈伤组织指纹图谱间的相似度，差异度为1减去

7、相似度值。首先，分析对甘草愈伤组织总黄酮含量具有极其显著影响的诱导培养条件（甘草种属、光照条件和外植体），结果显示，甘草种属（差异度=0.27）.光照条件（差异度=0.45）对甘草愈伤组织次生代谢产物的多样性具有非常显著的影响，诱导培养条件外植体（差异度=0.16）对甘草愈伤组织次生代谢产物的多样性具有显著的影响；接着，分析对甘草愈伤组织总黄酮含量无显著影响的诱导培养条件（激素组合），结果表明，激素组合对甘草愈伤组织次生代谢产物的多样性具有非常显著影响（差异度-0.37）,见表2。采用中药指纹图谱相似度评价系统

8、还可以得出甘草愈伤组织指纹图谱之间的共有峰和非共有峰。分析对甘草愈伤组织次生代谢产物多样性具有显著影响的诱导培养条件，结果显示不同的诱导培养条件下的甘草愈伤组织指纹图谱间共有峰及非共有峰的数量并没有显著的差别（A和B,A和C,C和D,D和E)o进一步对甘草愈伤组织中的峰面积占总峰面积百分比大于5%的色谱峰进行分析，可以看出相同色谱峰在不同指纹图谱中的峰面积是不同的，即同一化合物在不同的