地钱愈伤组织的诱导及其细胞培养条件的建立.doc

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1、地钱愈伤组织的诱导及其细胞培养条件的建立【摘要】目的探计对地钱愈伤组织的诱导和悬浮细胞培养的条件。方法用MSK2和MS培养基对地钱配子体进行愈伤组织诱导，运用模糊评判对MSK2培养基生长激素组合进行综合性状评价。结果MSK2和MS（2?mg/L6BA）均能诱导出地钱愈伤组织，其中MSK2的诱导效果较好。光照（3?000～8?000lux）能有效地促进地钱愈伤组织生长。激素配比组合是0.5?mg/L2,4D+2?mg/LNAA+2?mg/L6BA适合于地钱细胞生长以及次生代谢生产。结论地钱愈伤组织的诱导成功和悬浮细胞培

2、养条件的建立，为探索药用苔藓植物次生代谢产物生产提供新的途径以及对苔藓植物细胞规模化培养提供新的理论指导。【关键词】苔藓；地钱；愈伤组织；植物细胞培养　　ToinducecallustissuesandestablishsuspensioncultureofMarchantiapolymorphaL.MethodsMSK2andMSmediumswereusedtoinducegametophytesintocallustissues,andthefuzzycomprehensiveevaluationmethodwasused

3、toassesstheoptimalphytohormonecombination.ResultsBothMSK2andMS(2?mg/L6BA)mediumscouldinducecallustissueformation,andtheMSK2mediumwassuperiortotheMSmediumforcallustissueinduction.Lightintensity（3?0008?000lux）effectivelypromotedthecallustissuegrowth.Optimalphytohorm

4、onecombinationforcellgrowthandsecondarymetabolismproductionwas0.5?mg/L2,4D+2?mg/LNAA+2?mg/L6BA.ConclusionsSuccessfulinductionofthecallustissuesandestablishmentofsuspensioncultureofMarchantiapolymorphaL.provideanewpathwayforexploringthepharmaceuticalmosstoproduceseco

5、ndarymetabolismandnewtheoryguidanceforsuspensioncultureofmosscellsonalargescale.　　Keywords:Bryophyte;MarchantiapolymorphaL.;Callustissue;Cellculture　　1材料与方法　　1.1实验材料　　1.1.1无菌材料获得及愈伤组织诱导　　实验所用的地钱（Marchantiapolymorpha6L.）配子体由本实验室提供。将培养在温室内地钱上的湿沙洗掉，流水冲洗2?h，在无菌室内用无菌滤纸吸干，剪

6、成0.5?cm块状，放入7%NaClO消毒2?min，无菌水冲洗3次，于培养温度为25?℃，光照时间12?h/d，光强为5?000?lux的条件下。采用MS、MS（2?mg/L6BA）和MSK2［7］作为愈伤组织诱导培养基。以上培养基均添加0.9%琼脂，在高温灭菌前pH值调至5.8。　　1.1.2悬浮培养条件的建立　　悬浮细胞经液体培养基继代培养5代以上，作为细胞种子。选取MSK2、MS、KNOP、White、B5、Miller、1/2MSK2和1/2MS等用于筛选悬浮细胞培养基，将筛选得到对细胞生长良好培养基进行激素2,

7、4D、NAA和6BA（浓度0.5、1和2?mg/L）组合优化，以求建立对细胞生长和次生代谢合成均为有利的悬浮培养条件。第20?d取样进行各生化指标测定，重复3次。　　1.2实验方法　　1.2.1光照强度的设定　　将固体培养愈伤细胞置于培养温度25?℃，光照时间12?h/dHPG350HX智能型植物生长培养箱（黑龙江哈尔滨市东联电子技术开发有限公司）内，分别设定光照强度0、3?000、5?000和8?000lux来考察光照对细胞生长的影响。　　1.2.2pH的测定　　采用PHS2型精密酸度计(上海雷磁仪表厂)测定。　　1.2

8、.3叶绿素(chlorophyll)含量的测定　　采用丙酮乙醇混合液法测叶绿素含量［8］。将10?mL悬浮地钱细胞经3?000?r/min离心后，置于6?mL丙酮和无水乙醇等比例混合浸提液中，放于暗处，室温下进行浸提，652?nm处测定光密度，叶绿