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1、安徽农业科学,JournalofAnhuiAgri.Sci.2007,35(9):2562-2563责任编辑罗芸责任校对李洪SRAP分子标记及其应用张安世,邢智峰,刘永英,张为民(焦作师范高等专科学校生物系,河南焦作454001)摘要相关序列多态性(SRAP)是近年来发展起来的一种新型分子标记系统,具有简便、稳定、中等产率、高共显性、易于测序等优点。它利用独特的引物设计对ORFs进行扩增,正、反引物分别与外显子和内含子(或启动子)区域配对,因不同物种、不同个体的内含子、启动子与间隔区长度不等而产生多态性。SRAP2PCR扩增程序采
2、用复性变温法,前5个循环复性温度为35e,后35个循环为50e。目前SRAP已在植物图谱构建、遗传多样性评价、基因定位和比较基因组学等方面成功应用。关键词SRAP;分子标记;ORFs;PCR中图分类号Q75文献标识码A文章编号0517-6611(2007)09-02562-02[1][7]1974年Grodziker创立了RFLP技术,Botstein等首先利含子中则为32.1%和33.08%。从GenBank中随机选择20用此项技术于1980年构建了人类遗传连锁图谱,从此开创了个BAC序列,发现约66%的CCGG序列位于这些克隆
3、中的外分子标记技术的新纪元。目前,已经建立的DNA分子标记显子内。因此利用在不同个体中外显子的相对保守性及内技术有十多种,常用的有限制性片断长度多态性(RFLP)、随含子和启动子的可变性,通过正反引物的组合搭配扩增出基机扩增多态性(RAPD)、内部简单重复序列(ISSR)、扩增片断于内含子与外显子的SRAP多态性标记。长度多态性(AFLP)、微卫星DNA又称简单重复序列(SSR)、引物的大小是决定SRAP扩增成功与否的关键环节。Li简单序列长度多态性(SSLP)、酶切扩增多态性序列(CAPS)、等的研究表明,引物过短,易产生多重条
4、带,且重复性差;引单核苷酸多态性(SNP)、相关序列扩增多态性(SRAP)等,它们物过长,在放射自显影时背景太强。最适的SRAP引物在17已在动、植物和微生物等学科中得到了广泛的应用,并取得~18bp。同时在设计引物时还应避免自身配对并具有合适[2,6,8]了令人瞩目的进展。其中SRAP是一种基于PCR的新型标的G、C含量。目前文献已报道了部分引物序列。记,由美国加州大学作物系Li等[2]于2001年在研究芸薹作1.3DNA扩增和电泳SRAP反应的模板大多数是基因组物时开发出来的。它独特的引物设计使其可检测基因的可DNA,也可以是
5、cDNA。一般采用20~25Ll的反应体系,内含阅读框(ORF)区域,是一种无需任何序列信息即可直接PCR0.2mmol/LdNTPs,1.5mmol/LMgCl2,0.3Lmol/L引物,1UTaq扩增的新型分子标记技术,它既克服了RAPD重复性差的缺酶。SRAP分析的另一个特点是扩增采用复性变温法,共40点,又克服了AFLP技术复杂、成本昂贵的缺点,以其操作简个循环,即94e预变性5min;前5个循环:94e变性1min,35便迅速、成本低、可靠性好、重复性高、易于测序等特点迅速e复性1min,72e延伸1.5min;后35个
6、循环:94e变性1被各国分子生物学家所接受。目前此项技术已成功应用于min,50e复性1min,72e延伸1.5min;循环结束后72e延伸植物遗传图谱构建[2-3]、作物遗传多样性分析[4-5]、基因定7min,-4e保存。SRAP扩增反应结束后,扩增产物用变性[2][6]的聚丙烯酰胺凝胶分离,然后用放射自显影检测[9],可采用位及比较基因组学等方面。[5,10]1SRAP标记技术的介绍银染。除用6%的聚丙烯酰胺凝胶电泳外,也可用2%的[9]1.1SRAP的基本原理SRAP技术的基本原理是通过1对琼脂糖凝胶电泳分析多态性,但分辨
7、率较低。引物对ORFs进行扩增,分为正向引物(F2primer)和反向引物2SRAP标记技术在植物研究中的应用(R2primer)。正向引物长17bp,5c端的前10bp是一段填充序SRAP分子标记最早是在芸薹作物中开发出来,目前已列,无任何特异组成,接着是CCGG序列,这14bp组成核心在水稻、棉花、番茄、马铃薯、柑橘、大蒜、辣椒、黄瓜、芹菜、油序列,随后为3c端的选择性碱基,正向引物对外显子进行扩菜、拟南芥、小麦、烟草等植物研究中得到成功应用。自增。反向引物的组成与正向引物类似,区别在于反向引物长SRAP标记建立以来,已被应用
8、于图谱构建、比较基因组学、基因定位、遗传多样性分析和标定基因的研究。18bp,填充序列为11bp,接着是特异序列AATT,它们组成核2.1构建遗传图谱现有的分子标记技术由于在重复性、心序列,3c端仍然为3个选择性碱基,反向引物对内含子区域分辨率、技
