SRAP分子标记及其在蔬菜作物上的应用

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1、SRAP分子标记及其在蔬菜作物上的应用來源：《中国农学通报》.-2008(8).-69-72作者：赵光伟等阅读次数：3411SRAP标记的特点1.1SRAP标记的原理该技术针对基因外显子富含GC,内含子富含AT的特点，进行特殊的引物设计。其中，上游引物对外显子进行特异扩增，下游引物对内含子区域和启动子区域进行特异扩增。因个体不同以及物种的内含子、启动了与间隔区长度不等而产生多态性。目前，该标记已被应用于遗传图谱构建、比较基因组学、遗传多样性分析、分子标记等多个研究领域。1.2引物设计SRAP是基于PCR的分子标记系统，应遵循引物设计的基本要求：不

2、能产生二聚体和发夹结构，GC含正向引物：mel：5'-TGAGTCCAAACCGGATA-3'me2：5'-TGAGTCCAAACCGGAGC-3?me3：5'-TGAGTCCAAACCGGAAT-3'me4：5'-TGAGTCCAAACCGGACC-3'me5：5'-TGAGTCCAAACCGGAAG-3'尽管SRAP引物可以通用，但不同的引物组合对扩增多态性影响很大。钱文成等在利用SRAP检测黄瓜基因组多态性时发现，不同引物组合在亲本间多态性检测上存在很大差异。对于每个正向引物，在与不同的反向引物组合时，均能产生多态性条带，引物间产生多态性的

3、组合数较为稳定；而对于每一个反向引物,在与不同的正向引物组合时，引物间产生多态性的组合数则存在较大差别。因此，在选择引物时，要尽可能的增加正向引物数。1.3SRAP的DNA扩增SRAP进行DNA扩增时,前5个循环要求94°C变性lmin,35°C退火lmin,72°C延伸lmin；后35个循环将退火温度提高到50°C。降低第一次退火温度可以增强引物和模板的结合。第二次退火温度的提高保证了扩增产物的特异性，降低了非特异片段的比率。然而，不同物种或同一物种不同部位的材料扩增时对最适退火温度和退火时间的要求也有差异。冇研究认为，复性时间和温度比变性温度

4、和延仲时间对扩增效果影响大。目前，大白菜、廿蓝、黄瓜、番茄、甜菜、西瓜的SRAP反应体系已经建立。在建立反应体系时，主要围绕dNTP、模板、T“q聚合酶、引物、Mg2+浓度等影响因索进行研究。尽管他们在上说法不一。大多数学者都认为，dNTP、Taq聚合阳、Mg2+三者对扩增结果的影响都很大，不同的模板浓度扩增效果差别不大。进行PCR产物检测时，多数研究者选择6%的非变性聚丙量35%〜55%。引物大小是决定实验成功与否的关键，Li等发现引物过短，虽然增条带丰富，但稳定性差；引物过长；放射口显影时背景较深。最终将最适引物长度确定为上游17bp,下游1

5、8bp。其中，上游引物5,端开始的10个碱基为填充序列，加上CCGG组成核心序列，3,端为3个选择性碱基，进行外显子扩增，下游引物5,端的填充序列为11个碱基，加AATT组成核心序列，3'端也由3个选择性碱基组成，主要扩增内含子区域。下面是Li等开发的SRAP标准引物：反向引物：eml：5'-GACTGCGTACGAATTAAT-3?em2：5'-GACTGCGTACGAATTTGC-3'em3：5'-GACTGCGTACGAATTGAC-3'em4：5'-GACTGCGTACGAATTTGA-3'em5：5'-GACTGCGTACGAATTAA

6、C-3'em6：5'-GACTGCGTACGAATTGCA-3?烯酰胺凝胶进行电泳。吴鑫等建立柑桔SRAP分子标记体系吋，通过比较10%、8%、6%非变性聚内烯酰胺凝胶的电泳结果，认为SRAP-PCR产物片段较小，10%非变性PAGE效果最好。在可检测到扩增片段的情况下，循环次数越少越好，过多的循环次数可导致一些非特异产物的干扰，发生错误的比例也上升。2SRAP标记的应用2.1遗传图谱构建分子遗传图谱是指以遗传标记（已知性状的基因或特定DNA序列）间重组频率为基础的染色体或基因内位点的相对位置的线性排列图。高密度分子遗传图谱的构建是遗传学、分子生

7、物学研究中的一个重要领域,也是进行基因组测序、图位克隆、寻找与表型性状紧密连锁标记进行分子辅助冇种的重要工具和理论依据。但是，冃而的分了标记技术构建的甜瓜遗传图谱密度还不够高。实验表明，RAPI）、AFLP、SSR标记数量有限，难以使遗传图谱达到饱和，在甜瓜分子遗传图谱构建中标记偏分离比率变异为5.8%〜19.8%。因此，很多学者开始尝试利用新的标记技术，以期发现更多的分子标记来丰富现有的遗传图谱。Li等用SRAP技术对86个羽衣U•蓝X花椰菜的RI系作图，获得由130个SRAP标记和120个AFLP标记构成的遗传图谱，大约20%的多态性SRAP

8、（26个）标记为共显性分离。潘俊松等以黄瓜的2个自交系S06与S52杂交产生的F2为作图群体，应用SRAP标记构建黄瓜连锁图谱，筛选出的