胶体金试纸检测H5N1亚型禽流感病毒操作程序.doc

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1、胶体金试纸条检测H5N1亚型禽流感病毒操作程序1样品处理：取病变典型的肺脏和肝脏等发病器官，称重，磨碎，用生理盐水配成1：2（W/V）的组织悬液，反复冻融3次后，3000r/min离心30min，取上清液即为BC6/85强毒样品。2操作步骤2.1、将密封袋打开，取出试纸板/条。2.2、取40ul待检样本加在试纸条/板的加样区，在加样区滴加1滴稀释液。2.3、30分钟内观察并记录试验结果。3结果判断3.1阳性结果：在试纸条/板的检测线和质控线位置上各出现一条紫红色条带。3.2阴性结果：仅试纸条/板的质控线位置上出现一条紫红色条带。

2、3.3无效结果：在试纸条/板的检测线和质控线位置上均未出现紫红色条带。4注意事项4.1、被检样品、试剂应在室温〔20℃左右〕平衡并在该条件下检测。要求被检样品为新鲜样品。如发现试纸条/板密封袋破损则需废弃。4.2、当质控线与检测线上均不出现紫红色条带时，应重新测试，如果问题仍然存在，应立即停止使用此批号产品并与制造单位联系。4.3、当样品中抗体含量极高时，质控线条带有所减弱，此结果仍视为有效结果（若需进一步确证，可用抗体阴性血适量稀释后再作测试）。4.4、本产品仅供体外诊断初筛，勿作为确认试剂，阳性结果须进行确证试验确证。4.5

3、、本测试过程中需接触强毒样品，请按传染病试验室规程操作。4.6、30分钟后观察结果无效4.7、有效期12-18个月4.8、-20℃～20℃避光干燥保存。H5N1亚型禽流感病毒快速诊断试纸条的研制摘要：本文简述了如何以胶体金免疫层析技术，构造H5N1亚型禽流感病毒快速诊断试纸。该试纸主要由检测端，显色区和手柄区三部分组成，能够在短时间内完成对H5N1亚型禽流感病毒的诊断，且无需任何设备，具有简便快速、敏感、特异的特点。关键词：H5N1亚型禽流感病毒快速诊断试纸胶体金免疫层析H5N1亚型禽流感是由H5N1亚型禽流感病毒引起的一种急性

4、高度接触的传染病，给各国的养鸡业带来巨大的经济损失。目前该病的主要检测方法是琼脂扩散试验、HI、PCR技术等，这些方法都局限于实验室进行，并且需要熟练的检测人员，给疾病的检测带来极大的不便。为了建立快速、敏感的H5N1亚型禽流感病毒检测技术，本文探讨了如何用胶体金免疫层析技术构造H5N1亚型禽流感病毒快速诊断试纸.1.快速诊断试纸的原理快速诊断试纸首先利用的是免疫层析的原理，将抗原或抗体固定在层析介质上，相应的抗原或抗体通过毛细泳动，与特异性物质结合后即滞留在该位区，根据显色反应即可做出判断，显色技术用的是胶体金免疫显色，胶体金

5、颗粒易于制备，当每平方毫米空间的颗粒密度达到107时，即可出线肉眼可见的粉红色斑点，同时引起保存、使用方便而被广泛的应用于生物学、医学等领域。2.快速诊断试纸的构造快速诊断试纸根据胶体金免疫层析原理设计，由检测端，显色区和手柄区三部分组成，含有支撑层和反应试剂吸附层。测试端由玻璃纤维膜构成，吸附相应的抗原或抗体；显色区有硝酸纤维膜构成，其上含有判定结果的检测线和对照线；手柄端由吸水材料构成3.快速诊断试纸的研制思路在测试段玻璃纤维膜上包被金标记鼠抗AIV单克隆抗体（Au-Ab1）,再显色区NC膜的检测线和对照线处分别包被鼠抗AI

6、V单克隆抗体(Ab1)和兔抗鼠IgG多克隆抗体(Ab2)若待检液中含AIV，当检测液进入测试端时其中的Au-Ab1和AIV形成Au-Ab1—IBDV复合物，复合物在NC膜上层析泳动，被检测线上的Ab1拦截，形成Au-Ab1—AIV—Ab1的复合物，并在检测线处形成棕红色的条带；测试端多余的Au-Ab1在NC膜上继续泳动，别对照处的Ab2捕获，形成第二条棕红色条带。若待检液中不含AIV时，测试端的Au-Ab1在NC膜上泳动，不能被检测线处的Ab1拦截，直接与对照线处的Ab2结合，仅形成一条棕红色条带4.AIV快速诊断试纸的制作4．

7、1鼠抗AIV单克隆抗体的制备用纯化的AIV抗原免疫8日龄的Balb/c小鼠50ug/只，首次免疫用弗氏完全佐剂乳化抗原，加强免疫用弗氏不完全佐剂乳化抗原，共免疫2-3次，每次间隔2-6周。当用ELASA检测AIV血清抗体效价小于104时，用50微升纯抗原尾静脉超强免疫，去脾细胞与骨髓瘤细胞在50%PEG作用下进行细胞融合，HAT选择培养基培养，随后进行阳性克隆筛选，经小鼠腹腔诱生腹水，proteinG柱成析提纯IgG。4．2兔抗鼠IgG多克隆抗体的制备首先将Balb/c小鼠的血清采用辛酸-硫酸铵法加以纯化，已获得较纯的小鼠IgG

8、。具体过程为：离心后的一份血清用2份0.01MPh7.4PBS稀释，边搅拌边加入50%饱和硫酸铵，4摄氏度澄清2小时，13000r/min离心30min,弃沉淀。上清液调PH值至7.4。在加入35%饱和硫酸铵沉淀蛋白质，重复两次。沉淀物用少量PBS溶解，4摄氏度