检测a群猪轮状病毒胶体金免疫层析试纸条的制备

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1、引言1引言轮状病毒(Rotavims，RV)属于呼肠病毒科(Reoviridae)轮状病毒属(Rotavirus)，是引起婴幼儿和多种幼龄动物病毒性腹泻的主要病原之一。我国猪轮状病毒感染非常普遍，其中主要为A群感染。所有A群轮状病毒都具有共同的群特异性抗原VP6。VP6是核芯衣壳表面壳粒的重要成分，占病毒蛋白的51％，是病毒群特异性抗原，也是诊断试验中检测到的主要抗原。现已应用于人及动物RV腹泻的诊断方法主要有电镜(DEM)和固相免疫电镜技术(IEM)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、酶免疫实验(EIA)、聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)、荧光细胞检查(IF)、病毒分离、放

2、射免疫分析(RaA)、凝集试验、中和试验、补体结合试验(CF)以及PCR探针杂交、RT-PCR等技术。这些技术都能做出够准确的诊断，但是不适于现场应用。胶体金免疫层析法(gold．immunochromotographyassay，GICA)是20世纪80年代末发展起来的一种快速免疫学测定方法，它是胶体金标记技术和免疫层析技术相结合的产物。其基本原理是利用微孔滤膜的渗滤浓缩和毛细管作用，使抗原抗体反应在固相膜上快速进行，然后用胶体金标记的抗体来直接显色，阳性反应在膜上呈现红色，阴性反应则不形成红色。GICA全过程只需15min左右。与ELISA相比，即检测迅速又可避免底物

3、致癌性对人体的危害。本实验室已应用重组PRVVP6蛋白制备了群特异性单抗，为本实验展开提供了良好的开端。1．1轮状病毒的研究进展轮状病毒属于呼肠病毒科轮状病毒属，是引起婴幼儿和多种幼龄动物病毒性腹泻的主要病原之一。1968年美国的Mebus首次从犊牛粪便中分离到轮状病毒，1973年澳大利亚学者Bishop在胃肠炎患者的十二指肠超薄切片中发现了人轮状病毒，随后在欧美、澳洲、新西兰等各国发现了犊牛、绵羊及禽类等多种动物的轮状病毒。在我国，1979年庞其方等首次在腹泻患儿粪便标本中检测到轮状病毒(庞其方等，1979)，以后又在仔猪、犊牛、羔羊等多种动物粪便中分离到轮状病毒。目前

4、，轮状病毒感染引发的腹泻已发展成为一种世界性的疾病，给婴幼儿健康和畜牧业造成了严重的危害。1975年英国的Woode首次报道猪的轮状病毒感染由猪轮状病毒(PorcineRomvims，PRV)弓l起，14周龄仔猪的发病率超过80％(庞其方等，1979)。我国华东地区猪血清RV抗体阳性检出率为68．3％，四川地区仔猪血清RV抗体阳性检出率达72％。所以，该病毒在猪群中的感染和传播引起了世界各国的重视。对RV感染的治疗，目前尚无有效的药物，主要采取防止脱水和酸中毒等对症支持治疗，接种疫苗是有效防控该病暴发的最重要措施(斯特劳BE等，2000)。RV对婴幼儿的危害严重，医学界对

5、该病毒的研究比较重视，国内外学者先后从腹泻患儿粪便标本中分离出多株RV，对vp4、vp6和vp7主要结构基因进行了研究。我国于1982年分离到小牛的轮状病毒，又相继分离到猪、犬、羊、鸡等的轮状病毒，对轮状病毒的流行病学、病毒分离鉴定、诊断方法的建立和弱毒株的培养等方面作了大量的工作。耋jj銮些圭兰奎兰堡：，兰竺篁圣囊豢篓1．12轮状病毒表面抗原与分型Rv粒子表面有3种抗原：群抗原VP6、中和抗原vP7和血凝索抗原VP4。VP6由基因片段6编码，是病毒的内衣壳蛋白，是重要的群抗原(HsuGGetal，1997)。VP7由基囡片段9(或7、8，依不同毒株而异)编码，能刺微机体

6、产生中和抗体(EspulCetal，1993)。VP4由基因片段4编码，可被蛋白水解酶水解，叉l¨{蛋白酶一敏感蛋白口Tote驰e-SensitiveProtein)，具有血凝作用，同时也是诱导机体产生中和抗体的土要抗原(GoFzigliaMetal，1990；JohansenKetal，1997)·根据RV群抗原的不同及病毒ILNA末端指纹图谱的分析．可将其分为7个群(A43)，A群RV是最早发现的具有共同群抗原的典型RV，其电泳型为4：2：3：2型；B群_G群又称为非典型RV。，个群中可感染猪的有4群(A、B、C和E)。根据VP6抗原性不同将^群进一步分为两个亚引言群

7、(SGI，SG1I)，大多数哺乳动物RV属I亚群，而大多数人RV属II亚群。由于其表面蛋白VP7与VP4的高度可变性和均可以独立诱导产生中和抗体的特德，分别建立了依据蛋白vP7和VP4的两个独立的血清型分类系统，即由VP7决定的G型和由VP4决定的P型(I-IoshinoYetal。1996)。根据VP7和VP4的抗原性可将A组轮状病毒分为14个G型(G1．G14)及21个P型(P1．P21)。金奇等确定世界大多数国家和地区流行的人轮状病毒主要为G1型(金奇等，1997)；猪RV检测出10个G血清型(GI．G6，G8一G11)