h5n1亚型禽流感病毒拯救体系的建立

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1、H5N1亚型禽流感病毒拯救体系的建立46卷1期2006年2月4日微生物ActaMicrobiologicaSinica46(1):55—594February2006H5N1亚型禽流感病毒拯救体系的建立龙进学,吴艳涛,张小荣,王曲直,刘秀梵(扬州大学农业部畜禽传染病学重点开放实验室扬州225009)摘要:选择鸡胚高产的鸭源H5N1亚型禽流感病毒A/Duck/Shandong/093/2004株作为骨架病毒,在完成了全基因组序列测定基础上,设计合成的l1对引物对病毒的8个基因分l1段进行扩增.通过与转录载体PHW2000连接,构建A/SD/04的8个基因的拯救载体,经测序获

2、得序列准确的拯救质粒:241,242,243,244,245,246,247和248.A/SD/o4的8质粒与PR8(H1N1)进行不同组合的拯救,获得8个均含A/SD/04HA基因的H5重组流感病毒.鸡胚尿囊液中重组病毒的血凝效价在2一2,EID.在lO一lO之间,MDT在34～46h之问,均与野生A/SD/04(wtA/SD/04)相似.重组病毒对6周龄的SPF鸡的静脉接种指数(IVPI)与wtA/SD/04却有明显的差异,说明不同组合的内部基因影响病毒对鸡的致病力,但不影响病毒的鸡胚致死能力,对鸡胚的感染能力和病毒在鸡胚中的繁殖能力.构建的A/SD/04的8个质粒拯

3、救系统,为H5NI的基因功能研究和新型疫苗开发奠定基础.关键词:H5N1亚型禽流感病毒;8质粒拯救系统;病毒拯救;重组病毒中图分类号:Q78文献标识码:A文章编号:00016209(2006)O1.0055.05病毒拯救(Rescue)是20世纪90年代初发展起来的分子生物学技术,Neumann和Hoffmann等'分别建立了人流感A/WSN/33和A/PR/8(H1N1)的12质粒和8质粒系统,极大地促进了人流感病毒基因功能和疫苗开发等领域的深入研究,也取得了丰硕的成果.禽流感(Avianinfluenza,AI)方面的病毒拯救研究相对起步较晚,在97香港禽流感事件后才

4、得以加强j.我国的陈稚峰和卢建红等分别进行H1N1和H9N2流感病毒的拯救体系的建立.H5N1已成为目前严重危害养禽业的最重要疾病之一,对其进行病毒致病机理,病毒宿主范围的扩大,病毒的组织和细胞嗜性,基因功能研究以及高效新型疫苗的开发等诸多方面具有重要的意义.本文选择A/Duck/Shandong/093/2004株(简A/SD/04)作为骨架病毒进行拯救系统建立,是因为A/SD/04为2004年分离于鸭的H5N1亚型禽流感病毒,对鸡高度致病(IVPI=3.0),对BALB/C小鼠也具较高的致病力(人工滴鼻感染后的死亡率为33%),全基因序列分析结果认为A/SD/04是H

5、5NI间的自然重组病毒,没有H9N2的内部基因的重组.以A/SD/04作为骨架病毒,进行反向遗传学研究,在揭示当前H5N1宿主范围扩大的原因和H5N1如何获得对哺乳类动物致病性等方面具有重要的实际意义.A/SD/04具有良好的鸡胚繁殖性能,构建其全病毒的8质粒拯救系统,可替代PR8(H1N1)(提供内部基因)进行致弱H5等新型禽流感疫苗的研发.1材料和方法1.1材料1.1.1毒株,细胞,SPF鸡胚和检测抗体:A/Duck/Shandong/093/2004(简写A/SD/04)由本实验室分离并保存.中国农业科学院哈尔宾兽医研究所提供的H5亚型禽流感标准阳性血清,进行血凝抑

6、制试验(HI)确定为H5亚型AIV,对HA及NA全序列测定分型(序列已登录NCBI,登录号:AY845190,AY845191和AY856861～AY856866),鉴定为H5N1亚型AIV.细胞系COS一1用含10%胎牛血清的DMEM培养.SPF鸡胚购自山东省SPF鸡实验种鸡场.H9,H5和NDV单抗为本实验室研制,H1阳性血清为国家禽流感参考实验室陈化兰博士惠赠.1.1.2流感病毒8质粒拯救系统:美国St.Jude儿童研究医院的Webster博士惠赠.包括用于cDNA克隆的双向转录载体PHW2000,以及已经克隆好的A/PR/8/34(H1N1)(简PR8)的8个基因

7、cDNA至PHW2000的载体(编号:191,192,193,194,195,196,197和198,分别编码病毒的PB2,PB1,PA,HA,NP,基金项目:国家科技攻关项目(2004BA519A19);江苏省属高校重大基础研究项目(o5KJA23016).通讯作者Tel:86.514.7991416;Fax186.514—7972591;E-mail:xfliu@mail.yzu.edu.cn作者简介:龙进学(1976一),男,广西桂林人,博士研究生,主要从事禽流感病毒基因功能研究.E-mail:long.zx.1976@