检测禽流感H5亚型病毒的阻抗型免疫研究.pdf

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1、第40卷分析化学(FENXIHUAXUE)研究报告第10期2012年1O月ChineseJournalofAnalyticalChemistry1507～1513检测禽流感H5亚型病毒的阻抗型免疫研究颜小飞李运涛王蓉晖。林建涵温新华汪懋华安冬韩伟静俞育德YanbinLi。(中国农业大学教育部现代精细农业系统集成研究重点实验室，北京100083)(中国科学院半导体所集成光电子学国家重点实验室，北京100083)(DepartmentofBiologicalandAgriculturalEngineering，UniversityofArkansas，Fayetteville，AR72701，U

2、SA)摘要研制了一种可用于H5亚型禽流感病毒快速检测的阻抗型免疫传感器。通过蛋白A将H5N1表面抗原血凝素(HA)的单克隆抗体固定于金叉指阵列微电极表面，并与待测溶液中的目标抗原H5N1进行免疫反应。在『Fe(CN)3-溶液中进行电化学阻抗谱扫描，表征电极的表面修饰及抗原捕获过程。当H5N1病毒浓度在2t～2HAunif50L范围时，其浓度的对数值与叉指阵列微电极的电子传递阻抗的变化值呈线性关系，相关系数为0．9885；检出限为2。HAunit／50L，检测时间为1h。此传感器特异性好，灵敏度高，可以重复使用，在病原微生物快速检测领域具有良好的应用前景。关键词阻抗型免疫传感器；禽流感病毒；电

3、化学阻抗谱；叉指阵列微电极1引言禽流感病毒(Avianinfluenzavirus，AIV)对家禽养殖业危害巨大，也给人类健康和生命安全造成严重威胁，是世界动物卫生组织规定的A类传染病，我国也将其列为一类动物疫病。根据外膜血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)抗原特性的不同，AIV可分为16种HA亚型(H1～H16)和9种NA亚型(N1～N9)，高致病性禽流感均由H5和H7亚型引起[1]。目前，既能感染禽类又能感染人类的AIV亚型为H5N1，H9N2，H7N7，H7N2和H7N3等，其中感染H5N1的患者病情严重，死亡率高。据世界卫生组织(wHO)报道，自2003年至今，H5N1感染人类的病例为

4、606例，死亡357例，死亡率高达58．9％。为了保障国民的生命财产安全，建立快速、准确、特异的AIV检测技术已迫在眉睫，并成为目前研究的热点问题之一【4]。AIV检测的常用方法主要包括病毒分离鉴定、酶联免疫吸附(ELISA)[5】、聚合酶链式反应(PCR)溉、核酸序列扩增(NASBA)]、环介导等温扩增(LAMP)和生物传感器叫等方法。其中，病毒分离鉴定是诊断AIV的经典方法[1”，具有准确、敏感的优点，但操作繁杂、耗时较长，检测时间需要5～7d，无法满足快速检测的要求。ELISA，PCR，NASBA和LAMP等方法能够检测出各种样品中的AIV，但这些方法或特异性差，或敏感性低，或操作复杂

5、，或需要昂贵的仪器设备及专业的技术人员，难以对AIV进行快速、准确的检测，不利于实际应用中对禽流感疫情的有效预警及防治。近年来，生物传感器在病原微生物快速检测中的应用受到各国学者的重视，出现了多种用于AIV检测的生物传感器，如电化学传感器、表面等离子体共振(SPR)传感器[161、石英晶体微天平(QCM)传感器[1、光学干涉生物传感器等，具有操作简便、灵敏、快速的优点，但普遍处于初步探索阶段，其检测的稳定性和可靠性尚需进一步改进。本研究以灭活的AIVH5N1为检测对象，通过蛋白A将单克隆抗体固定于金叉指阵列微电极表面，制备了一种阻抗型免疫传感器。以Fe(CN)作为氧化还原对，用电化学阻抗谱表

6、征电极表面修饰及抗原捕获过程，并采用等效电路阐释其阻抗谱变化。实验结果表明，待测溶液中灭活的H5N1病毒浓度的对数值与叉指阵列微电极的电子传递阻抗的变化值呈线性关系。2012—02-14收稿；2012-03—27接受本文系国际科技交流与合作专项(No．2010DFA31000)资助E-mail：wangmh@can．edu．cn第lO期颜小飞等：检测禽流感H5亚型病毒的阻抗型免疫传感器研究1509闭环境下保存待用。2．3．4病毒捕获在表面固定有特异性抗体的叉指微电极表面滴加3O待测溶液，室温下孵育1h，使待测溶液中的目标病毒与电极表面的抗体进行免疫结合，然后用超纯水冲洗，并用氮气干燥。2．3

7、．5电化学阻抗谱测量利用电化学阻抗谱对电极表面修饰的各个步骤及抗原捕获过程进行表征。电解质溶液为含有1mol／LKC1和10mmol／L[Fe(CN)63-(1：1，v／)的PBS(10mmol／L，pH7．4)缓冲液，测量频率范围为20Hz～1MHz，外加交流电压幅值为10mV。记录反应过程中的Nyquist阻抗谱(阻抗实部vs阻抗虚部)，用ZView软件建立等效电路模型并进行阻抗谱拟合。3结果与讨论3．1