绿色荧光蛋白转基因小鼠胎肝干细胞在体内外定向分化的潜能.pdf

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1、·358·中华消化外科杂志2014年5月第13卷第5期ChinJDigSurg，May2014，Vo1．13，No．5·论著·绿色荧光蛋白转基因小鼠胎肝干细胞在体内外定向分化的潜能黄启科党立力阮柏张卓超刘杰王兴郑志刚陶开山【摘要】目的探讨绿色荧光蛋白转基因小鼠胎肝干细胞(FLSCs)在体内及体外定向分化的潜能。方法取孕13d绿色荧光蛋白(GFP)转基因C57BL／6J小鼠胚胎肝脏，经机械消化和胶原酶消化获得FLSCs并扩大培养；成熟肝细胞来自于同品系小鼠成体肝脏，通过两步灌注胶原酶消化法提取，流式细胞仪鉴定其干细胞标志物的表达及自我增殖能力，RT—PC

2、R及Westernblot测定AFP表达；分别将FLSCs经肝细胞生长因子(HGF)及TGF—B诱导分化后，Real—timePCR检测Alb、角蛋白CK一7、8、19mRNA以及Westernblot检测Alb、角蛋白CK一7、8、19蛋白在诱导前后的表达变化，鉴定其向肝细胞和胆管细胞双向分化的能力；经尾静脉注射FLSCs到野生型C57BL／6J肝切除小鼠体内，观察其在肝内重构肝组织的能力。计量资料采用t检验，各时相点比较采用重复测量的方差分析，两两比较采用LSD—t检验。结果成功克隆FLSCs细胞。流式细胞仪检测分离的FLSCs表达上皮细胞黏附分子

3、(EpCAM)、CD133、CD49f干细胞标志物，其阳性表达率分别为78．6％4-3．3％、31．7％±2．5％、47．6％4-1．8％。AFPmRNA在FCs和成熟肝细胞中的相对表达量分别为0．640-4-0．115和0．053-4-0．012，蛋白相对表达量分别为1．383±0．265和0．243±0．227，两者比较，差异有统计学意义(t=8．772，5．354，P<0．05)。超低黏附培养皿培养FLPCs和成熟肝细胞，其形成克隆球数目分别为(234．04-57．0)个和(5．0±2．O)个，两者比较，差异有统计学意义(t：12．711，P<0

4、．05)。体外HGF诱导FLSCs分化，Alb、CK一8mRNA表达分别在8、10d到达峰值，分别为0．851±0．030和0．771-40．031；两者蛋白水平于第1O天达峰值，分别为4．573±0．015和1．562±0．029。体外TGF—B诱导FISCs分化，CK一7、CK一19mRNA在第12天达峰值，分别为15．454±2．152和10．675-4-1．822；两者蛋白水平于第14天达峰值，分别为3．4234-0．105和1．8924-0．081。在移植有FLSCs的肝切除小鼠体内可检测到表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的成熟肝细胞及胆管

5、细胞。结论分离的绿色荧光蛋白转基因FLSCs能够稳定表达绿色荧光，具有显著的肝干细胞特征和向肝细胞和胆管细胞双向分化的潜能，且在体内研究中具有良好的示踪性。【关键词】绿色荧光蛋白转基因小鼠；胎肝干细胞；分离；鉴定；示踪ProtentialofdirecteddifierentiationoffetalliverstemcellsingreenfluorescentproteintransgenicmiceinvivoandinvitroHuangQike，DangLili，RuanBai，ZhangZhuochao，Liufie，Wang，ZhengZ

6、higang，TaoKaishan．DepartmentofHepatobiliarySurgery，XifingHospital，theFourthMilitaryMedicalUniversity，Xian710032，ChinaCorrespondingauthor：TaoKaishan，Emaif：taokaishan0686@163．corn【Abstract】0bjeetiveToinvestigatethepotentialofdirecteddifferentiationoffetalliverstemcellsfFLSCs)inmic

7、ewithsponataneousgreenfluorescencenvitroandnvivo．MethodsFLSCsweretakenfromgreenfluorescentproteintransgenicmiceatembryonicday13．Aftermechanicaldissectionandenzymedigestionwithcollagenase，FLSCswerefurthercultured．Theexpressionofstemcellrelatedmarkersandtheself-renewalabilitywerei

8、dentifiedbyflowcytometry．Theexpressionofalphafe