绿色荧光蛋白转基因小鼠脂肪间充质干细胞的多向分化潜能论文

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1、绿色荧光蛋白转基因小鼠脂肪间充质干细胞的多向分化潜能论文孙雅娟,刘鲁川,金岩,邓蔓菁,方军,陆伟,杨振华【摘要】目的:研究绿色荧光蛋白(GFP)转基因小鼠脂肪间充质干细胞(ADSC)体外定向诱导下的多向分化潜能.方法:取出生后4d的GFP转基因小鼠腹股沟的皮下脂肪组织,经过胶原酶消化,加入脂肪组织来源干细胞条件培养基中培养.将生长状态良好的第5代GFPADSCs分别加入成骨及成脂条件培养液进行体外多向分化诱导研究.并分别采用茜素红钙盐染色和油红O染色进行鉴定.结果:成功获得了稳定表达GFP的ADSCs.free

2、lultilineagepotentialofadiposetissuederivedstromalcells(ADSCs)fromtransgenicmicethegroinregionofa4dayoldGFPtransgenicmouse,andincubatedinacollagenasesolution,thencultivatedinconditionedculturemediumtoobtainGFPADSCs.Thepassage5GFPADSCsinductionmediumorad

3、ipogenicmediumrespectively.Aftercalciuminduction,thealizarinredstainingedtotesttheformationofcalciumconcentration.TheadipoinducedMSCsthetransgenicmiceinduction,jacinthcalciumsaltscouldbedetectedinthecellsbyalizarinredstaining.Atday10afterbeingadipoinduced,t

4、hecellsshoultilineagepotentialofADSCs,.freelechanismofmultilineagepotentialoftheADSCsinvivo.【Keyice;adiposetissuederivedstromalcells;multilineagepotential0引言脂肪组织来源干细胞(adiposetissuederivedstemcells,ADSCs),由于来源广泛,取材方便,具有多向分化潜能,已成为近年组织工程学研究热点[1-2].有关其参与组织修复及

5、重塑的在体研究逐年增多.绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein,GFP)转基因小鼠为寻求一种良好的示踪工具提供了一个很好的细胞来源[3].本研究在体外培养GFP转基因小鼠脂肪间充质干细胞(GFPADSCs),探讨GFP的变化及其多向分化潜能,为进一步在体研究ADSCs分化机制提供实验基础.1材料和方法1.1材料出生4d的GFP小鼠由第四军医大学口腔医院组织工程中心提供.D/F12培养基、胰酶、Ⅰ型胶原酶(美国Gibco公司);胎牛血清(杭州四季青犊牛应用研究所);地塞米松、维生素C,吲哚美

6、辛,IBMX,胰岛素(美国Sigma公司).1.2方法1.2.1ADSCs的分离和培养取GFP小鼠6只,引颈处死后750mL/L乙醇消毒10min,超净台内取腹股沟部脂肪组织,去除血管及其它组织,用含双抗0.1mol/LPBS反复冲洗3次,用剪刀将脂肪组织剪成1mm3小块,625万U/L的Ⅰ型胶原酶,37℃消化50min,加入两被体积的PBS,反复吹打,200μm筛网过滤形成单细胞悬液,800r/min离心5min,弃去上层的脂肪及上清,再加入PBS液重悬细胞再次离心,反复2次,收集细胞并进行细胞计数,以1×10

7、6的密度接种于培养瓶中,陪养液含100mL/LFBS,0.1mol/LNEAA的D/F12(1∶1),置37℃50mL/LCO2培养箱中常规培养,原代2d后换液,细胞长满80%时用胰酶消化传代培养.1.2.2ADSCs多向分化诱导取生长状态良好的第5代GFPADSC,2.5g/L胰酶消化细胞,以5×107/L接种于放有玻片的6孔板内,第2日换用诱导液.1.2.2.1ADSCs成骨诱导诱导液为地塞米松10μmol/L,VitC50μmol/L,β磷酸甘油钠10mmol/L,含100mL/L胎牛血清的D/F12.诱

8、导液每周更换3次,20d后成骨诱导爬片进行茜素红染色,40g/L多聚甲醛固定1.5h,PBS漂洗,然后浸入10g/L硝酸银水溶液,紫外光照射1h,蒸留水冲洗尽量去除银汞液,50g/L硫代硫酸钠水溶液中浸2min,自来水冲洗,10g/L中性红复染胞核30s,乙醇脱水,二甲苯透明,树脂封片,然后显微镜下观察.1.2.2.2ADSCs成脂诱导诱导液为地塞米松1μmol/L,吲哚

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