绿色荧光蛋白转基因小鼠脂肪间充质干细胞的多向分化潜能

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1、绿色荧光蛋白转基因小鼠脂肪间充质干细胞的多向分化潜能：孙雅娟，刘鲁川，金岩，邓蔓菁，方军，陆伟，杨振华【摘要】目的:研究绿色荧光蛋白(GFP)转基因小鼠脂肪间充质干细胞(ADSC)体外定向诱导下的多向分化潜能.方法：取出生后4d的GFP转基因小鼠腹股沟的皮下脂肪组织,经过胶原酶消化，加入脂肪组织干细胞条件培养基中培养.将生长状态良好的第5代GFPADSCs分别加入成骨及成脂条件培养液进行体外多向分化诱导研究.并分别采用茜素红钙盐染色和油红O染色进行鉴定.结果：成功获得了稳定表达GFP的ADSCs，GFPADSC经成骨诱导20d后茜素红染色可见有橘红色钙盐沉积;经成脂诱导

2、10d后油红O染色阳性.结论：GFP作为报告基因在ADSCs分化过程中没有被关闭，亦未影响到ASCs的多向分化潜能，是ADSC在体多向分化研究的一个有效示踪工具.【关键词】绿色荧光蛋白;　转基因小鼠;　脂肪间充质干细胞;　多向分化潜能　　【Abstract】AIM:Tostudythemultilineagepotentialofadiposetissuederivedstromalcells(ADSCs)fromtransgenicmicethegroinregionofa4dayoldGFPtransgenicmouse,andincubatedinacolla

3、genasesolution,thencultivatedinconditionedculturemediumtoobtainGFPADSCs.Thepassage5GFPADSCsinductionmediumoradipogenicmediumrespectively.Aftercalciuminduction,thealizarinredstainingedtotesttheformationofcalciumconcentration.TheadipoinducedMSCsthetransgenicmiceinduction,jacinthcalciumsal

4、tscouldbedetectedinthecellsbyalizarinredstaining.Atday10afterbeingadipoinduced,thecellsshoultilineagepotentialofADSCs,echanismofmultilineagepotentialoftheADSCsinvivo.　　　　【Keyice;adiposetissuederivedstromalcells;multilineagepotential　　0引言　　脂肪组织干细胞(adiposetissuederivedstemcells,ADSCs),由

5、于广泛,取材方便,具有多向分化潜能，已成为近年组织工程学研究热点［1-2］.有关其参与组织修复及重塑的在体研究逐年增多.绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein,GFP)转基因小鼠为寻求一种良好的示踪工具提供了一个很好的细胞［3］.本研究在体外培养GFP转基因小鼠脂肪间充质干细胞(GFPADSCs),探讨GFP的变化及其多向分化潜能，为进一步在体研究ADSCs分化机制提供实验基础.　　1材料和方法　　1.1材料出生4d的GFP小鼠由第四军医大学口腔医院组织工程中心提供.D/F12培养基、胰酶、Ⅰ型胶原酶(美国Gibco公司)；胎牛血清(杭州四季青犊牛应

6、用研究所)；地塞米松、维生素C，吲哚美辛，IBMX,胰岛素（美国Sigma公司）.　　1.2方法　　1.2.1ADSCs的分离和培养取GFP小鼠6只,引颈处死后750mL/L乙醇消毒10min,超净台内取腹股沟部脂肪组织,去除血管及其它组织,用含双抗0.1mol/LPBS反复冲洗3次，用剪刀将脂肪组织剪成1mm3小块,625万U/L的Ⅰ型胶原酶,37℃消化50min,加入两被体积的PBS，反复吹打，200μm筛网过滤形成单细胞悬液,800r/min离心5min,弃去上层的脂肪及上清,再加入PBS液重悬细胞再次离心，反复2次，收集细胞并进行细胞计数,以1×106的密度接种于培

7、养瓶中,陪养液含100mL/LFBS,0.1mol/LNEAA的D/F12（1∶1），置37℃50mL/LCO2培养箱中常规培养,原代2d后换液,细胞长满80%时用胰酶消化传代培养.　　1.2.2ADSCs多向分化诱导取生长状态良好的第5代GFPADSC,2.5g/L胰酶消化细胞,以5×107/L接种于放有玻片的6孔板内,第2日换用诱导液.　　1.2.2.1ADSCs成骨诱导诱导液为地塞米松10μmol/L,VitC50μmol/L,β磷酸甘油钠10mmol/L,含100mL/L胎牛血清的D/F12.诱导液每周更