谷胱甘肽发酵条件的优化扩大和分离纯化发酵工程.doc

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1、摘要谷胱甘肽(GSH)是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸组成的三肽化合物，具有清除自由基、解毒、抑制衰老、预防糖尿病和癌症、抑制艾滋病毒、提高人体免疫力等重要生理功能，在医学、食品、化妆品等领域具有广泛的市场前景。现有GSH生产能力远不能满足市场需求，所以采用GSH高产菌株发酵廉价原料转化为GSH，建立适合工业化分离纯化GSH的方法会带来巨大的社会和经济效益。本文以富含GSH的啤酒酵母Y-14为材料，分别从以下四个方面进行研究：(1)利用Plackett-Burman试验设计、Box-Behnken试验设计法对啤酒酵母Y-14

2、产GSH培养基进行优化，得到的最适培养基配方为:葡萄糖20g/L，酵母膏10g/L，(NH4)2SO48g/L，KH2PO43g/L，MgSO40.15g/L。对优化结果进行验证试验，GSH产量可达到124.77mg/L。(2)利用单因素试验对啤酒酵母Y-14产GSH发酵条件进行研究，结果得到摇瓶最适发酵条件为培养温度30℃、初始pH6.0、摇床转速180rpm、摇瓶装液量30mL/300mL、补料培养基添加时间20h。在此条件下，菌体胞GSH含量达到31.56mg/g，GSH的产量可达249.2mg/L，较原来提高了1

3、02%。(3)利用10L自动发酵罐补料培养啤酒酵母Y-14，①采用恒速流加单一葡萄糖培养基，20h时添加前体氨基酸和ATP的方法，测得GSH的产量在52h时，达到最大值243mg/L。②采用恒速流加全营养培养基，36h时添加补料培养基的方法，测得GSH产量在52h达到最大值520.742mg/L。比较发现，第二批发酵罐培养菌体干重、GSH产量较第一批分别提高了122.5%、114.2%。(4)采用D001大孔树脂粗分离GSH，得到最佳分离条件为：上样pH3.0，浓度为61.4mg/100mL，流速为0.5mL/min，洗

4、杂质用液为无水乙醇，洗脱液为1.5%HCl+0.3mol/LNaCl，流速为3mL/min。GSH的平均收得率为69.11%，蛋白质去除率为64.8%。然后通过SephadexG-10脱盐纯化GSH，得到最适条件：Φ1.6cm×25cm玻璃层析柱，上样浓度为116.66mg/100mL，上样体积为20mL。结果GSH的平均收得率为96.21%。最后SephadexG-10分级分离纯化GSH，采用Φ1.6cm×50cm玻璃层析柱，最适上样体积为2mL，GSH的平均收得率为99.26%，蛋白质去除率为56.5%。GSH浓缩倍

5、数平均为9.07倍，纯化倍数为8.67倍。关键词：啤酒酵母Y-14，谷胱甘肽，发酵罐，D001大孔树脂，SephadexG-10AbstractGlutathione(GSH)isatripeptideformedbyglutamicacid,cysteineandglycin,ithasimportantphysiologicalfunctionssuchasremovingfreeradical,detoxification,anti-aging,diabetesandcancerprevention,inhibit

6、ionofHIVandimprovetheeffectivenessofthehumanimmunesystem,andhasawiderangeofmarketprospectsinthefieldsofmedical,foodandcosmetics.ButtheexistingproductioncapacityofGSHisfarfromthemarketdemand.UsemicrobialfermentationtotranslatecheaprawmaterialsintohighyieldedGSH,an

7、destablishsuitableindustrializationseparationandpurificationofGSHwillbringenormoussocialandeconomicbenefits.Inthispaper,themainresearchcontentandresultsareasfollows:(1)UsingPlackett-BurmanandBox-BehnkenexperimentaldesignoptimizedmediumofSaccharomycescerevisiaeY-1

8、4whichproducingGSH.Theoptimummediumwasglucose20g/mL,yeastextract10g/mL,(NH4)2SO48g/mL,KH2PO43g/mL,MgSO40.15g/mL.TheoptimumexperimentshowedthatGSHyieldreachedto