沙冬青抗寒因的克隆、功能分析与遗传转化研究.doc

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1、沙冬青抗寒基因的克隆、功能分析与遗传转化研究（作者：刘美芹，导师：尹伟伦教授）摘要低温是影响植物正常生长发育的重要环境因子，揭示植物的抗寒机理，培育抗寒新品种具有重要的理论和实际意义。至今人们对植物低温抗性获得机制的了解仍很有限，尤其是对寒温带木本植物获得顺利越冬抗寒力的过程了解更少，而寒温带木本植物对维持北方寒冷地区的生态平衡起重要作用。本文针对生态建设中缺乏抗寒植物的生产急需问题，对我国北方内蒙古荒漠地区特有的常绿阔叶灌木沙冬青的抗寒性分子调控机制进行研究，期望为抗寒良种选育及生物工程定向育种提供理论和技术支持。沙冬青是亚洲中部的一种强抗

2、逆植物，生长在荒漠地带，是国家三级保护植物，对维持当地生态平衡起着重要的作用。沙冬青具有耐热、旱、盐碱等多种抗性，尤其能忍受冬季-30℃的低温，是理想的研究植物抗寒性的材料。目前对沙冬青抗逆性的研究多限于细胞组织结构的观察，虽然分离到几种热稳定的抗冻蛋白,但还没有从次生代谢物产物及抗逆基因方面进行研究的报道。据此，本文探讨了多酚与沙冬青抗寒性的关系；首次用自行优化的固相扣除杂交方法，从低温驯化的沙冬青幼苗中克隆到多个低温诱导基因,并进行了功能分析与GenBank注册；将克隆到的其中一个基因AmCIP，通过烟草异位表达分析、亚细胞定位分析和原核

3、表达分析等方法进行了功能鉴定和三倍体毛白杨的应用转化研究。主要研究结果如下：针对沙冬青次生代谢产物含量很高的特点，就多酚类物质的含量与抗寒性的提高之间的关系进行了研究。将沙冬青幼苗在2℃-6℃条件下驯化14天后，检测发现抗寒力明显提高。电镜细胞化学定位方法观察到经低温驯化的幼苗子叶细胞中，多酚类物质在液泡、液泡膜附近大量积累。定量分析发现，低温驯化使沙冬青子叶内的多酚含量提高。说明低温驯化后，沙冬青中具有抗氧化剂活性的多酚的积累，可能对抗寒力的提高起重要作用。低温抗性是受多基因调控的数量性状。本文选用自行优化的固相扣除杂交技术，以分离克隆多个

4、沙冬青低温抗性基因。该优化方法操作简单，快捷，集多种扣除杂交方法的优点于一体，可以同时分离得到多个全长基因。扣除后得到的候选基因，经两轮杂交筛选后，得到11个差异显著且有编码区的克隆，分别在GenBank上进行了注册，序列号是AY590122，AY843521，AY846361，AY846362，AY846363，AY846364，AY843522，AY843523，AY843524,AY843525，AY843526。这11个克隆中有三个是全长cDNA，含有完整的开放阅读框，其中两个编码区完全一致，都编码植物防御素；另一个编码植物LEA蛋白

5、。其余的8个克隆中有两个是编码低分子量的低温-干旱诱导蛋白的基因，两个是编码光合系统元件蛋白的基因，一个H+转运ATPase的mRNA相似基因以及一个14-3-3蛋白同源基因。这11个克隆编码的蛋白属于不同的种类，可能参与渗透调节、光合系统调整、能量代谢及信号转导等，说明沙冬青的抗冻性形成过程至少有这些代谢过程的参与，揭示了沙冬青低温抗性的形成是受多因素调控的复杂过程。从以上筛选到的这些差异克隆可以看出沙冬青低温抗性获得过程的复杂性，但要了解其各个过程的作用机制，还需要对单个基因进行深入研究。因此，本文将低温驯化后表达量明显提高的克隆B12进

6、行5’端RACE扩增，得到全长806bp的类脱水素基因AmCIP，并进行了序列结构分析和功能预测。经基因组DNA扩增及序列分析发现该基因没有内含子。Northern杂交结果又表明AmCIP基因在对照材料中几乎没有表达，而在低温驯化植株中却有大量表达，在驯化植株胚根中的表达量又明显高于子叶中的表达量。可见AmCIP的表达与沙冬青抗寒力的提高直接相关，尤其是能提高较幼嫩脆弱的胚根的抗寒力。为进一步鉴定AmCIP的功能，将AmCIP分别连接到35S启动子和rd29A启动子（Prd29A）下游，构建双元表达载体，并采用农杆菌介导的叶盘转化法转化烟草。

7、转基因烟草的基因组PCR扩增,Southern及Northern杂交分析均证明目的基因已整合进烟草基因组中并且能在烟草细胞中表达。对T0代的多个转基因株系的低温抗性检测发现低温下（-2℃～4℃）转基因烟草株系的离子渗漏率降低，膜稳定性增强，零下2℃处理后的存活率增加，尤其是转Prd29A-AmCIP组合的株系。可见AmCIP的异位表达能明显提高植物的低温抗性，AmCIP可能具有低温保护蛋白功能，能在低温下保护细胞大分子及质膜的稳定性。由于AmCIP是类脱水素基因，推测能保护植物细胞抵抗水分胁迫。对叶片的保水力测定结果发现，转基因烟草离体叶片的

8、保水力比野生型烟草的保水力增强。PEG与NaCl处理过程中转基因烟草的生长状况优于野生型烟草，而且长时间处理后存活的转基因烟草叶片都有发达的栅栏组织，细胞排列致密的