花生AhWRKY75基因的克隆、遗传转化及功能分析

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1、分类号密级UDC单位代码10435硕士学位论文花生AhWRKY75基因的克隆、遗传转化及功能分析Cloning,GeneticTransformationandFunctionalAnalysisofAhWRKY75genefromArachishypogaeaL.研究生姓名郭悦指导教师乔利仙教授学科专业生物化学与分子生物学研究方向植物基因工程中国.青岛2018年6月Cloning,GeneticTransformationandFunctionalAnalysisofAhWRKY75genefromArachishypogaeaL.ThesissubmittedtoQing

2、daoAgriculturalUniversityInFulfillmentoftheRequirementfortheDegreeofMasterofAgronomyGuoYue（DepartmentofAgronomy）Supervisor:QiaoLixianQingdao.ChinaJune,2018独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得青岛农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做

3、的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：时间：年月日关于论文使用授权的说明本人完全了解青岛农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意青岛农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。(保密的学位论文在解密后应遵守此协议)研究生签名：时间：年月日导师签名：时间：年月日青岛农业大学硕士学位论文摘要花生AhWRKY75基因的克隆、遗传转化及功能分析摘要随着我国耕地面积的锐减以及土地盐渍化的日益加剧，挖掘耐盐相关基因、创制耐

4、盐新材料、培育耐盐新品种成为育种的重要目标以及有效利用盐碱地的有效手段。本研究根据前期获得的花生栽培种转录组和表达谱数据库，筛选获得107个WRKY基因，其中73个含有完整阅读框。与拟南芥（Arabidopsisthaliana）同源比对结果表明，73个WRKY基因中有8个WRKY基因属于第三亚族，其余都属于第二亚族的不同亚家族。通过比较盐胁迫处理前后耐盐突变体S2和诱变亲本S4的数字表达文库，筛选获得35个受盐胁迫诱导表达的WRKY基因。这些基因在3号和6号染色体上分布较多。35个WRKY基因的外显子和内含子数量相差较大，基因片段的长度最少为870bp左右，最长已经超过50

5、00bp。这些WRKY基因所编码氨基酸个数在134aa~1101aa之间，分子量大小在5861Da~126106Da之间，等电点大小在4.26~12.0之间。荧光定量（RT-qPCR）分析耐盐突变体S2和诱变亲本S4经盐胁迫处理后5个不同时间段AhWRKY75基因的表达量变化，发现在胁迫处理后12h时表达量最高，且在S2中AhWRKY75基因表达量是S4表达量的4倍。提取耐盐突变体S2总RNA,经反转录获得cDNA，以cDNA为模板进行扩增测序后获得AhWRKY75基因序列，该序列与花生栽培种的WRKY75基因（登录号：AHA06G2420.1）序列完全一致。生物信息学分析结

6、果表明，AhWRKY75基因只有一个WRKY结构域和一个C2H2的锌指结构（C-X4-C-X23-H-X-H），属于WRKYGQK类型结构域。与其他物种WRKY75蛋白进行序列比对，AhWRKY75蛋白与花生栽培种、拟南芥、琴叶拟南芥亚种、油菜、野生烟草、巴西橡胶树和白菜的同源性分别为100%、90%、90%、65%、58%、58%和37%。将AhWRKY75基因连接到P-super1300质粒上构建过表达载体P-super1300-AhWRKY75，并利用花粉管注射法将表达载体转入花生品种‘花育23’中，获得阳性转基因植株。通过RT-qPCR检测到转基因植株中AhWRKY7

7、5基因的表达量是对照植株‘花育23’的14~21倍。在250mMNacl胁迫处理后72小时，转基因植株的叶片萎蔫程度明显弱于非转基因对照植株。利用光合仪测得转基因植株净光合速率（Pn）、气孔导度（GS）及蒸腾速率（Tr）数值均显著高于非转基因植株，胞间CO2浓度（Ci）显著低于非转基因植株。RT-qPCR检测到转基因植株叶片中抗逆相关基因AhCSD1、AhCSD2、AhCAT以及AhPOD基因的表达量均显著高于非转基因植株（p<0.05）。转基因植株中SOD、POD以及CAT酶活性亦均显著高于非转基因对