紫花苜蓿MsIPI基因克隆及对烟草的遗传转化

《紫花苜蓿MsIPI基因克隆及对烟草的遗传转化》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、摘要紫花苜蓿重要次生代谢产物皂苷属萜类化合物，异戊烯基焦磷酸异构酶(isopentenyldiphosphateisomerase,简称IPI)是植物体萜类化合物合成途径中的一个关键酶，其作用是将直接用于萜类合成的两个基本物质IPP和他的异构物DMAPP在一定条件下进行相互转化。紫花苜蓿是优良的豆科牧草，目前在我国及世界各地都有大量栽培利用，其中所含皂苷具有重要的生物活性和药理作用。通过对异戊烯基焦磷酸异构酶基因的研究，对于提高和控制其在植物体内的生化活性具有重要意义。对已公布的异戊烯基焦磷酸异构酶EST序列进行搜索和比对，选取了与紫花苜蓿亲缘关系最近的蒺藜苜蓿的IPI基因EST序列为基准设

2、计引物，利用RT-PCR技术，扩增获得MsIPI基因cDNA全序列。该基因开放阅读框全长870bp，编码290个氨基酸残基。利用DNAMAN对该基因的氨基酸序列进行了生物性息学分析，经同源比对和进化树分析，MsIPI基因的氨基酸序列与蒺藜苜蓿、烟草、拟南芥、水稻、高粱的异戊烯基焦磷酸异构酶氨基酸序列一致性达到90℅以上。植物的表达载体构建，是将获得的EST序列插入到植物表达载体pBI121上，构建了超表达MsIPI基因的表达载体pBI-IPI，再通过农杆菌介导法转化农杆菌，利用叶盘法转化烟草，以期得到MsIPI基因超量表达的烟草转基因植株。对再生植株进行抗生素筛选和PCR、RT-PCR检测，

3、结果6株呈现阳性，证实目的基因已经整合到烟草基因组中，已获得了转基因植株。通过GUS基因组织化学染色检测，初步证实该基因可以顺利转录。关键词：紫花苜蓿；异戊烯基焦磷酸异构酶；基因克隆；载体构建；烟草转化CloningofMsIPIGenefromAlfalfa(MedicagosativaL.)andTransformationofTobaccosAbstractSaponinsfromMedicagospeciesarepentacyclictriterpenes,andtheyareofthemostimportantsecondarymetabolitesofMedicagosativ

4、alL..Isopentenyldiphosphateisomerase(IPI)isakeyenzymeworkinginthebiosynthesisprogressofterpenoidsinplants,anditplaysanimportantroleinintroconvertingIPPanditsisomerDMAPPintoeachotherundercertainconditions.Medicagosatival.LisaneximiousleguminousforagewhichhasbeenplantedwidelyinChinaandallovertheworld

5、.SaponinsfromM.sativalL.takespecialpharmacologicaleffectsfortheirparticularbiologicalactivities.MsIPIisakeygenecontrollingbiosynthesisofsaponinsinMedicagospecies.Researchonthisgeneisofgreatimportanceincontrollingandimprovingbiochemicalactivitiesofsaponinsinplants.Bysearchingandcomparingthepublicate

6、dIsopentenylpyrophosphateisomeraseESTsequences,ESTsequencesoftheIPIgenefromTribulusterrestrisL.whichhastheclosestgeneticrelationshipwithM.sativalwasusedtodesignreferenceprimers.MsIPIwasamplifiedbyRT-PCRtoobtainafulllengthofcDNA.ThecDNAsequenceincludeda870bpopenreadingframewhichencoded290aminoacidre

7、sidues.AcomparisonoftheaminoacidsequenceswascarriedoutbyDNAmantoanalysetheirbiologicalinformation,theresultsshowedthattherewasasimilarityofmorethan90%betweentheaminoacidsequencesandthoseinTribulusterrestris