基于PTEN调控的EGCG诱导人胰腺癌细胞凋亡作用.pdf

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1、齐齐哈尔医学院学报2015年第36卷第18期JournalofOiqiharUniversityofMedicine，2015，Vo1．36，No．18．论著．基于PTEN调控的EGCG诱导人胰腺癌细胞凋亡作用刘适徐忠玲孙利刘颖李成冲李鸿梅张伟李成军秦伟【摘要】目的研究EGCG在PTEN正常表达及低表达时对胰腺癌细胞增殖、凋亡及PI3K／Akt／mTOR信号通路相关蛋白表达的影响。方法人胰腺癌细胞、沉默PTEN表达的人胰腺癌细胞分别分成EGCG处理组及未处理组，以CCK．8法检测细胞增殖变化、以流式细胞术检测细胞凋亡变化、以westernblot法检测PI3K／AkmT0R通路相关蛋

2、白表达的变化。结果EGCG抑制胰腺癌细胞增殖、诱导其凋亡，下调pAkt和p．mT0R表达的作用在PTEN沉默细胞有所减弱。结论EGCG以调控PTEN表达的方式抑制胰腺癌细胞增殖、诱导其凋亡，并下调其pAkt和P—mTOR的表达。【关键词】胰腺癌；EGCG；PTEN；PI3K；AktmTOR胰腺癌是恶性程度最高的肿瘤之一，其5年生存率不足24、48、72小时，然后加入CCK．8孵育2小时，最后检测5％1]，而其发病率呈逐年上升趋势，而常规方法疗效欠佳，450nm吸光度。细胞增殖抑制率以如下公式计算：抑制率故近年来国内外开展很多抗胰腺癌新药物的相关研究。(％)=(1一治疗组OD值／对照组

3、OD值)×100％。本实验EGCG(表没食子儿茶素没食子酸酯)是绿茶中含量最为丰富重复三次。的茶多酚，它可以在肿瘤形成的多个阶段发挥抗癌作用，4．细胞凋亡检测：PTEN正常及低表达BxPC-3细胞收获、它能以多种机制作用于多种通路或靶点发挥抗癌作用，洗涤后加入10lannexinV—FITC和10l碘化丙啶，然后在其中就包括PI3K／AkmT0R通路J，此通路的激活可以抑室温暗室孵育10分钟，染色后用FACSCalibur流式细胞仪分制肿瘤细胞凋亡、促进其增殖、促进肿瘤血管生成、促进肿瘤析细胞，右下象限标示为早期凋亡细胞，右上象限标示为晚期侵袭及转移。PTEN是一个非常重要的抑癌基因

4、，也是凋亡细胞。本实验重复三次。PI3K／Akt／mTOR通路的一个重要调控因子。本研究通过观5．Westernblot实验：PTEN正常及低表达BxPC-3细胞以察EGCG处理PTEN正常或低表达胰腺癌细胞的凋亡及冰PBS洗涤后加入裂解缓冲液孵育30分钟，离心后采用PI3K／AkmT0R通路相关蛋白表达的变化初步揭示了EGCGBCA试剂盒检测蛋白浓度，然后将等量的蛋白以80V以15％抗胰腺癌的机制。SDS．PAGE分离1．5小时，随后在100V下PVDF膜转膜2．5小时，最后室温下以封闭液封闭1小时，膜以含TBST一抗孵材料与方法育过夜后以二抗孵育。将蛋白条带洗涤后以ECL系统进行

5、1．YI3gN基因沉默：以慢病毒转导法沉默人胰腺癌BxPC一分析。本实验重复三次。3细胞PTEN的表达。首先以含PTEN或者荧光素酶的6．统计学分析：本实验数据以SPSS18．0软件处理，数值shRNA转导人胰腺癌细胞24小时，然后于转导后第36、48、以均数±标准差(-4-s)表示，两个数值间差异以Student"st—60、72小时收获细胞上清液，随后将上清液过滤、离心、重悬test检验，三个以上数值间差异以one—wayANOVA检验，P<浮，最后将含shPTEN和shLuc的慢病毒颗粒以适当浓度转导0．05标记为显著性差异。入BxPC3细胞。PTEN沉默效果以Westernb

6、lot法检测，本实结果验重复三次。2．细胞培养及处理：PTEN正常及低表达BxPC-3细胞培1．RNAi抑制胰腺癌细胞PTEN的表达：结果显示将包含shPTEN和shLuc的慢病毒颗粒以适当浓度转导人BxPC-3细养于含10％胎牛血清的RPMI1640培养基，分别给予40g／胞后各处理组B—actin表达水平与对照组比较无差异(P>ml的EGCG和去离子水处理48小时，然后采用CCK一8法检测细胞活性，采用流式细胞术检测细胞凋亡变化，采用0．05)，shPTEN组PTEN表达水平显著低于对照组(P

7、shLue组PTEN表达水平与对照组比较无明显差异，详化。见图1。2．EGCG通过PTEN抑制胰腺癌细胞增殖：PTEN正常或3．CCK．8实验：PTEN正常及低表达BxPC-3细胞接种于低表达BxPC-3细胞经4Ornl的EGCG或去离子水处理96孔板，于37。C孵育24小时后以4Oml的EGCG处理24、48、72小时后用CCK一8法检测细胞增殖抑制率。结果显基金项目：本研究由黑龙江省教育厅科技面上项目资助示EGCG组细胞增殖抑制率显著高于shPTEN组