抗巨细胞病毒pp65抗原单克隆抗体的制备及临床初步比对检测.pdf

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检验医学与临床2Ol4年12月第11卷第23期LabMedClin，December2014，Vo1．12，No．23·3269··论著·抗巨细胞病毒pp65抗原单克隆抗体的制备及临床初步比对检测陈兰兰，崔京涛，倪安平△，闫文娟(中国医学科学院北京协和医院检验科，北京100730)【摘要】目的制备抗巨细胞病毒pp65单克隆抗体并建立外周血巨细胞病毒抗原血症免疫荧光检测方法。方法cMVAD169感染人胚胎肺成纤维细胞MRc5后24、48、72h，超声波破碎和甲醛灭活制备CMV抗原，以及CMVpp65重组抗原免疫BAIB／C小鼠，标准方法制备抗巨细胞病毒pp65单克隆抗体。利用所得单克隆抗体建立检测外周血巨细胞病毒抗原血症检测的实验方法，并与进口试剂盒CMVBriteKit进行比对。结果共有两株杂交瘤细胞产生特异性抗体，克隆名称为13D1—3和29F1—1，免疫球蛋白亚型分别是IgG1型和IgG2a型，制备的腹水抗体纯化后仍具有良好的免疫学特性。单克隆抗体13D1—3与CMVBriteKit试剂盒比对，阳性符合率为88．8，阴性符合率为98．9，总符合率为97．3／00，Kappa值为0．895，吻合度较高。结论成功制备抗巨细胞病毒pp65单克隆抗体，建立以13D1—3单克隆抗体为基础的检测外周血巨细胞病毒抗原血症方法，与CMVBriteKit试剂盒比对具有良好的符合性。【关键词】巨细胞病毒；单克隆抗体；抗原血症DoI：10．3969／j．issn．1672-9455．2014．23．015文献标志码：A文章编号：1672—9455(2014)23—3269-03ThepreparationofmonoclonalantibodiesagainsttheCMVpp65antigenandpreliminaryclinicalcomparisontestCHENLan—lan，CUIJing—tao，NJAn—ping，yAN肌一juan(DepartmentoJClinicalLaboratories，ChineseAcademyofMedicalSciencesandPekingUnionMedicalCollege，Beijing100730，China)[Abstract]ObjectiveTopreparemonoclonalantibodies(McAbs)againsttheCMVpp65antigen，andestab—lishimmumofluorescencemethodfordetectionofCMVantigenemiainperipheralbloodleukocytes．Methods24，48，72hafterCMVAD169infectedhumanembryoniclungfibroblast(MRC一5)，CMVantigenwaspreparedthroughul—trasonicfragmentationandformalininactivation，BAIB／CmicewereimmunonizedbytheCMVpp65antigens，andthestandardmethodwasusedtoproducemonoclonalantibodiesagainsttheCMVpp65antigen．Thepreparedmono—clona1antibodieswereusedtoestablishimmumofluoreseencemethodfordetectionofCMVantigenemiainperiphera1bloodleukocytes．andtheestablishedmethodwascomparedtoCMVBritekit．ResultsTherewastwohybridomacellsproducingspecificmonoclonalantibodies．andnamed13D1—3and29F1—1。respectively．Theimrnunoglobulinsub—typeswereIgG1andIgG2a．Afterpurification，monoclonalantibodiesofascitesfluidalsohadgoodimmunologicalcharacteristics．Comparedmonoclonalantibody13D1—3withCMVBritekit，thepositivecoincidenceratewas88．8，negativecoincidenceratewas98．9andthetotalcoincidenceratewas97．3o,4(kappa=0．895)，predictedhighconsistency．ConclusionThisstudymighthavesuccessfullyproducedmonoclonalantibodiesagainsttheCMVpp65antigenandestablishedimmumofluorescencemethodfordetectionofCMVantigenemiainperipheralbloodleu—kocytes．whichcouldindicatehighconsistencycomparedwithCMVBritekit．[Keywords]Cytomegaovirus；monoclona1antibody；antigenemia人巨细胞病毒(HcMV／cMV)在患者体内的活动性复制l材料与方法会影响患者基础疾病的疗效及预后，可能诱导或加重自身免疫1．1材料与试剂CMVAD169毒株来自国家疾病预防控制疾病，甚至威胁思者生命]。因此早期诊断、及时治疗可有效中心；人胚肺成纤维细胞(MRC一5)，即ATCCCCI一17l，购自美预防CMV病的发生，改善基础疾病的预后。Vander等在国标准生物品收藏中心(ATcC)；小鼠骨髓瘤细胞(NS-1细1988年报道采用单克隆抗体检测外周血白细胞核内巨细胞病胞)来自英国南安普敦大学医学院微生物系；SPF级BAIB／C毒低基质结构磷蛋白抗原(CMVpp65抗原)。CMVpp65抗小鼠由北京协和医院动物实验中心外购并寄养；DMEM培养原血症仍是目前公认的CMV活动性感染早期、快速诊断指基和RPMI1640培养基购自Invitrogen公司；胎牛血清为HY—标，该指标的诊断敏感性高于病毒培养，且与CMV—DNA核酸Clone公司产品；融合剂PEG4000、HAT培养基添加物、FITC检测具有相同的敏感性_4]。但目前国内CMVpp65抗原检测标记的羊抗鼠IgG抗体、鼠类单克隆抗体免疫球蛋白亚型鉴定试剂几乎均为进口，价格昂贵。本文利用CMV抗原免疫小试剂盒、非离子去污剂IGEPALCA一630、Lowry法蛋白浓度检鼠，制备抗CMVpp65的单克隆抗体，建立外周血检测方法，测酚试剂、完全和不完全福氏佐剂、降植烷均购自Sigma公司；并与CMVBriteTMKit比对，结果报道如下。重组CMVpp65抗原购自杭州启泰生物技术有限公司；CMV作者简介：陈兰兰，女，硕士，主要从事巨细胞病毒感染和梅毒感染的诊断研究。通讯作者：E—mail：niap@pumch．cn。 ·3274·检验医学与临床2014年l2月第11卷第23期LabMedClin，1)ecember2O14，Vo1．12，No．23种菌以上的混合感染可以很好的辨别、不易漏检。并且．CPS4iacoilinnondisinfectedwaterEJ1．JMicrobialMethods，显色培养基能抑制变形卡1：菌的辽徙生长，有利于混合菌的分2007，68(3)：522529．离。实验中发现用CPS4显色培养基分离混合感染菌33株，r3]CiragilP，GulM，AralM，eta1．Evaluationofanewchro传统分离方法有4株漏检。mogenicmediumforisolationandidentificationofcon1一与传统的分离鉴定方法相比，CPS4显色培养基仍存在不monurinarytractpathogens[J]．EurJClinMicrobiolIn—足之处。本研究发现，『{】CPS4色培养基检测，其中有5株fectDis，2006，25：l08111．大肠埃希菌、1株肠球菌未被检出；可能是这些菌株产生的8[4]朱德妹，汪复，胡付品．2010年中CHINE：[尿液标本中葡萄醛酸糖苷酶和(或)B半乳糖苷酶含量较少或活性较弱，不细菌的分布和耐药性监测[J]．中国感染j化疗杂志，足以游离出足够的产色基团而使菌落显色，亦可能是这些菌株2012，12(4)：241-250．在此次CPS4显色培养基中产生影响葡萄醛酸糖苷酶活性Es]杨自副，陈默蕊．定位显色培养齄任细菌快速初步定ljI的物质，从而干扰显色效果j。此外，弧菌属细菌由于对盐的的应用[J]．国际检验医学杂志，2011，32(7)：760—762．特别需求在此培养基上几乎不生长；实验中发现有2株棒状杆[6]谢国艳，高志生．快速鉴定大肠埃希菌方法的临『末适刚惟菌、1株丹毒丝菌不生长；某些真菌生长慢。上述现象町能与的评估¨J]．现代检验医学杂志，2011，26(4)：96—97．细菌所需营养和生长速度不同，或培养基l11加入的抑菌剂成分[7]赵声远，陈交雯，乍林徽．娃色培养基联合简生化试验及浓度有关。]。签定常见氧化酶阴性兰『5J]H卡r隋的能力验证[J]．I{】华综上所述，用CPS4显色培养基做尿道病原菌的分离和鉴微生物学和免疫学杂志，2013，33(7)：525—530．定，省去了对菌株进行纯培养的步骤，直接根据菌落颜色就可[8]潘高辉，毛彩萍．科玛嘉尿道定位显色培养基的应用评价以做出初步判断，可简化鉴定程序，提高检测效率，有助于泌尿I-j]．中国微q|态学杂志，2006，18(2)：140．道感染的快速诊断，值得临床推广。[9]李艳梅，刘洋，杨慧娟．用尿道定位艟色平板鉴定大肠埃希惋、肺炎兜饼伯菌的方法评估[J]．古林医学，2o10，参考文献31(24)：4154．[1]叶应妩，王毓三，申子瑜．全国临床检验操作规程[M]．3[】O]张淑红，郑扬云，吴清平．两种大肠朴闭显色培养基检测版．南京：东南大学出版社，2006：801—821．效果的比较[J]．食研究与开发，2012，33(10)：130—133．[2]PitkanenT，PaakkariP，MiettinenIT，eta1．ComparisonofmediaforenumerationofcoliformbacteriaandEscherich一(收稿日期：201402—10修回日期：2o14-0704)(上接第3271页)[9]吕静娟，胡文胜，余坚，等．温州市区育龄妇女孕前巨细胞[3]ChangM，PanMR，ChenDY，eta1．Humancytomegalov—病毒感染现状调查[J]．中旧优，遗传杂志，2011，19iruspp65lowermatrixprotein：ahumoralimmunogenfor(2)：100—101．systemiclupuserythematosuspatientsandautoantibody[10]万琼，訾富uJ]，邬I和，等．f]f札病异瑟闪造血f细胞移植acceleratorforNZB／WF1mice[J]．ClinExpImmunol，受者臣细胞病毒感染的检测及l床意义LJ]．国际检验医2006，143(1)：167—179．学杂志，2010，31(8)：874—875．[4]CarianiE，PollaraCP，VallonciniB，eta1．Relationshipbe—[11]官琳妹，蔡鹏，汪艳．肾移植术后巨细胞病毒pp65检测的tweenpp65antigenemialevelsandreal—timequantitative临床意义[J]．中国微乍态学杂志，2012，24(2)：165—166．DNAPCRforHumanCytomegalovirus(HeMV)man—[12]翟文静，魏嘉琳，赵明峰，等．臣细胞病毒定量PCR与agementinimmunoeompromisedpatients~J]．BMCInfectpp65抗原测定舱测异基因造血厂细胞移植臣细胞病毒Dis，2007，7(2)：138．感染的比较EJ]．巾园实验I血液学杂志，2009，17(6)：1522—r5]SuiG，SoohooC，AffarelB，eta1．ADNAvector-based1526．RNAitechnologytosuppressgeneexpressioninmamma—r13]SaracinoA，ColucciR，IatorracaA，eta1．Theeffectsofliancells[J]．ProcNatlAcadSciUSA，2002，99(8)：preemptivetherapyusingaverylowthresholdofpp6555l5—552O．antigenemiatopreventcytomegalovirusdiseaseinkidney[6]谷鸿喜，张风民，凌虹．细胞培养技术[M]．北京：北京大transplantrecipients：asinglecenterexperience[J]．学医学出版社，2012：194198．TransplantProc，2013，45(1)：182～l84．E7]崔京涛，倪安平，吴nfN，等．自身免疫病和非13身免疫病[14]李薇，麦颖，张璇．流式细胞术分析HCMVPP65抗原1，F患者巨细胞病毒抗原m症检测及抗病毒治疗后复检观察外周m各有核细胞}rfI的表达及意义[J]．现代检验医学[J]．中华医学杂志，2012，92(34)：2426—2429．杂志，2O]0，25(2)：61-6，i．[8]俞苏蒙，I1-r晓波，邢云卿，等．新兵人群人巨细胞病毒感染的血清流行病学调查[J]．现代预防医学，2010，37(20)：(收稿日期：2O1401—1o修日期：2014-0612)3927—3928．