人巨细胞病毒pp65基因的原核表达及初步应用

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1、夏宇人巨细胞病毒PP65基因的原核表达及初步应用人巨细胞病毒PP65基因的原核表达及初步应用摘要人巨细胞病毒(humancytomegalovirus，HCMV)是疱疹病毒科中最大的一种病毒。HCMV在人群中感染广泛，在正常人群中通常造成无症状感染或持续感染，但在免疫缺陷患者中可引起严重后果。孕妇感染HCMV后，容易经母婴途径传播给胎儿，造成胎儿畸形、智力低下、神经系统异常。因此孕妇的产前检测意义重大。酶联免疫吸附试验(ELISA)是一种最常用的检测HCMV抗体的方法。然而，大多ELISA商品试剂盒所用的是单表位的重组蛋白抗原。为提高HCMV抗体检测的敏感性、特异性和

2、准确性，推荐用双表位或多表位的重组蛋白试剂盒来诊断HCMV感染。HCMV被膜磷蛋白pp65表明有T细胞和B细胞表位，可诱导中和抗体的产生。我们试图通过基因重组技术制备HCMVpp65重组蛋白，并将其用作HCMV感染的诊断抗原。研究目的：通过基因重组制备HCMVpp65重组蛋白，并将其用于人巨细胞病毒感染的免疫学诊断。’研究方法：根据GenBank中公布的HCMVPP65基因序列，自行设计一对引物，PCR扩增目的基因片段，然后对纯化的PCR产物及pGEX．4T-1载体质粒用&D尺I和BamHI两种限制性核酸内切酶进行双酶切并纯化回收，连接回收产物，构建pGEX．4T-1

3、／PP65重组质粒，对重组质粒进行鉴定。将pGEX．4T-1／PP65重组质粒转化宿主大肠杆菌BL2l(DE3)，而后用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达，经SDS．PAGE电泳检测验证其表达产物后，用亲和层析技术对上清中的融合蛋白进行纯化，用ELISA间接法对已纯化的GST／pp65融合蛋白的特性进行鉴定。纯化的GST／pp65用做ELISA诊断抗原检测423例人血清，并与商品试剂盒做了比较。研究结果：通过PCR成功扩增PP65基因；成功构建重组质粒pGEX．4T-1／PP65；成功表达GST／pp65重组蛋白；GST／pp65重组蛋白与HCMV抗体结合的特

4、异性较好。研究结论：GST／pp65重组蛋白能用作HCMV诊断抗原。关键词：人巨细胞病毒；GST／pp65重组蛋白；克隆；表达；纯化；ELISA扬州大学硕士学位论文ProkaryoticexpressionandpreliminaryapplicationofhumanCVtOmegalOVlmSppO)geneinproKaryotlcsvstelTI·，■-一JLJL1—4’Abstract2一Humancytomegalovirus(HCMV)isthelargestmemberotthefamilyofhumanherpesviruses．Itisawides

5、preadpathogenwhichisresponsibleforgenerallyasymptomaticandpersistentinfectionsinhealthypeople．Howeveritmaycauseseverediseaseinimmunocompromisedindividuals．Iteasilyspreadsfrompregnantwomentotheirfetusthroughverticaltransmission，resultinginfetalmalformations，mentalretardationandnervoussys

6、temabnormalities．SoitisofgreatsignificancetoprenataldetectionofHCMVinfectioninpregnantwomen．Enzyme-linkedimmunosorbentassay(ELISA)isamostcommonlyusedmethodofthedetectionofHCMVantibody．However,manycommercialELISAkitsbasedonrecombinantantigenprepared．Inordertoimprovethesensitivity,specifi

7、cityandaccuracyofHCMVantibodydetection，therecombinantproteinhadbeenrecommendedtoreplacethewhole-virusantigenfordiagnosingHCMVinfection．Themembranephosphoproteinpp65ofHCMVcontainTcellepitopesandBcellepitopes，whichCaninduceneutralizingantibodies．Therecombinantproteinpp65willbeexp