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时间:2019-02-26
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1、夏宇人巨细胞病毒PP65基因的原核表达及初步应用人巨细胞病毒PP65基因的原核表达及初步应用摘要人巨细胞病毒(humancytomegalovirus,HCMV)是疱疹病毒科中最大的一种病毒。HCMV在人群中感染广泛,在正常人群中通常造成无症状感染或持续感染,但在免疫缺陷患者中可引起严重后果。孕妇感染HCMV后,容易经母婴途径传播给胎儿,造成胎儿畸形、智力低下、神经系统异常。因此孕妇的产前检测意义重大。酶联免疫吸附试验(ELISA)是一种最常用的检测HCMV抗体的方法。然而,大多ELISA商品试剂盒所用的是单表位的重组蛋白抗原。为提高HCMV抗体检测的敏感性、特异性和
2、准确性,推荐用双表位或多表位的重组蛋白试剂盒来诊断HCMV感染。HCMV被膜磷蛋白pp65表明有T细胞和B细胞表位,可诱导中和抗体的产生。我们试图通过基因重组技术制备HCMVpp65重组蛋白,并将其用作HCMV感染的诊断抗原。研究目的:通过基因重组制备HCMVpp65重组蛋白,并将其用于人巨细胞病毒感染的免疫学诊断。’研究方法:根据GenBank中公布的HCMVPP65基因序列,自行设计一对引物,PCR扩增目的基因片段,然后对纯化的PCR产物及pGEX.4T-1载体质粒用&D尺I和BamHI两种限制性核酸内切酶进行双酶切并纯化回收,连接回收产物,构建pGEX.4T-1
3、/PP65重组质粒,对重组质粒进行鉴定。将pGEX.4T-1/PP65重组质粒转化宿主大肠杆菌BL2l(DE3),而后用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达,经SDS.PAGE电泳检测验证其表达产物后,用亲和层析技术对上清中的融合蛋白进行纯化,用ELISA间接法对已纯化的GST/pp65融合蛋白的特性进行鉴定。纯化的GST/pp65用做ELISA诊断抗原检测423例人血清,并与商品试剂盒做了比较。研究结果:通过PCR成功扩增PP65基因;成功构建重组质粒pGEX.4T-1/PP65;成功表达GST/pp65重组蛋白;GST/pp65重组蛋白与HCMV抗体结合的特
4、异性较好。研究结论:GST/pp65重组蛋白能用作HCMV诊断抗原。关键词:人巨细胞病毒;GST/pp65重组蛋白;克隆;表达;纯化;ELISA扬州大学硕士学位论文ProkaryoticexpressionandpreliminaryapplicationofhumanCVtOmegalOVlmSppO)geneinproKaryotlcsvstelTI·,■-一JLJL1—4’Abstract2一Humancytomegalovirus(HCMV)isthelargestmemberotthefamilyofhumanherpesviruses.Itisawides
5、preadpathogenwhichisresponsibleforgenerallyasymptomaticandpersistentinfectionsinhealthypeople.Howeveritmaycauseseverediseaseinimmunocompromisedindividuals.Iteasilyspreadsfrompregnantwomentotheirfetusthroughverticaltransmission,resultinginfetalmalformations,mentalretardationandnervoussys
6、temabnormalities.SoitisofgreatsignificancetoprenataldetectionofHCMVinfectioninpregnantwomen.Enzyme-linkedimmunosorbentassay(ELISA)isamostcommonlyusedmethodofthedetectionofHCMVantibody.However,manycommercialELISAkitsbasedonrecombinantantigenprepared.Inordertoimprovethesensitivity,specifi
7、cityandaccuracyofHCMVantibodydetection,therecombinantproteinhadbeenrecommendedtoreplacethewhole-virusantigenfordiagnosingHCMVinfection.Themembranephosphoproteinpp65ofHCMVcontainTcellepitopesandBcellepitopes,whichCaninduceneutralizingantibodies.Therecombinantproteinpp65willbeexp
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