人巨细胞病毒pp65基因片段原核表达、鉴定以及酵母表达载体构建

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1、山西医科大学磺士学位论文人巨细胞病毒pp65基因片段的原核表达、鉴定以及酵母表达载体的构建摘要目的选择HCMVpp65基因中能激发CTL和B细胞免疫的优势抗原表位基因pp65(1087—1515nt)基因片段，PCR扩增片段，构建表达载体并在原核细胞中进行功能性表达，进一步鉴定表达蛋白的抗原性；构建酵母pPIC9K—pp65真核表达载体。方法参考pET-21a(+)载体序列多克隆位点，根据pp65(1087—1515nt)基因序列设计引物，碱性质粒抽提法提取含有HCMVpp65全长基因的pGEM-T—pp65质粒，通过聚合酶链反应(PcR)获得目的pp65(10

2、87—1515nt)基因。PCR产物经BamHI和XhoI双酶切、T4连接酶连接、蓝白斑筛选构建pET-21a(+)一pp65质粒；经酶切鉴定及核酸序列测定后，将重组质粒转入BL21(DE3)诱导表达；表达的蛋白进行SDS—PAGE电泳并经westernblot鉴定pp65融合蛋白的抗原性；包涵体蛋白经过复性纯化包被聚苯乙烯微量反应板，ELISA法检测pp65融合蛋白的抗原性。参考pPIC9K载体序列多克隆位点，根据pp65(1087—1515nt)基因序列设计引物，以pGEM-T—pp65质粒为摸板，PCR获得目的pp65(1087—1515nt)基因。PCR

3、产物与pMDl9一一Tsimple载体连接，蓝白斑筛选构建的pMDl9一一Tsimple—pp65质粒，经酶切、测序鉴定后，以SnaBI和BlnI酶切pMDl9一simple—pp65质粒和pPIC9K载体，T4连接酶连接，转化至DH5a感受态细胞。结果本研究克隆了HCMVpp65(1087—1515nt)基因，成功构建了pET一21a(+)一pp65重组质粒，获得了稳定表达pET一21a(+)一pp65的原核表达体系，westernblot和ELISA证实得到了具有抗原活性的ppG5融合蛋白片段：此外成功构建了pPIC9K—pp65酵母表达载体。结论构建了稳定

4、的pET一21a(+)-pp65原核表达体系，获得了具有活性、纯度较高的pp65蛋白片段，此外也成功构建了酵母表达载体pPIC9K—pp65，为大量制备活性pp65蛋白片段、HcMv感染检测试剂的研发和HcM、，亚单位疫苗制备提供基础，也为进一步研究pp65的生物学功能奠定实验基础。关键词巨细胞病毒，pp65蛋白，原核表达，变性，复性，Pichiapastods，pPIC9K山西医科大学硕士学位论文Prokaryoticexpression，identificationofhumancytomegaloviruspp65fragmentandestablishm

5、entofitseukarvoticpPIC9KexpressionvectorAbstractobjectiveToselectthepp65genefragmentcontainingthepredominanceepitopesandclonethepp65genefragment．Then,toconstructtheprokaryoticexpressionsystemforexpressingthepp65fragmentandidentifytheimmunologicalcharacteroftheexpressedprotein．Andalso

6、toestablishthepPIC9Keukaryoticexpressionvector．Methodspp65genewasamplifiedbyPCR．Theprimersweredesignedwiththemulti-clonesitesintheexpressionplasmidpET21a(+)andthepp65gene．ThetemplewaspGEM·T-pp65plasmidcontainingthetotalpp65gene．ThroughBamHIandXhoIdoubledigesting、T4ligaseligating、blue

7、-whitespotscreening，thepp65fragmentwassubelonedintothepET21a(+)expressionvectorsocalledpET-21a(+)·pp65．TheidentifiedpET-21a(+)一pp65wastmnsfectedintoE．coliBL21(DE3)．TheproteinWaspurifiedbyHis-tagnickelpostandidentifiedbywesternblottingandELISA．Thepp65geneWasamplifiedbyPCR．Theprimerswe

8、redesignedwi