人巨细胞病毒pp65抗原elisa检测试剂的研制

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——万方数据⋯}’!坠!：}!!’i：：塑：上堂j!!迨皇单位代码：10114学l?：201010013人巨细胞病毒PP65抗原ELISA检测试剂的研制研究指导教师：樊里垩教援申请学位门类级别：科堂堂焦专业器称：微生物堂研究方向：痘壹鱼痊所在学院：出酉医科太堂基趟匡堂院中国山西二。一四年三月 ———i磊面姻瞒■万方数据论文作者签名：2：l送么日期：趁!车年—厶月—卫日。学位论文版权使用授权书本人完全了解山西医科大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅：本人授权山西医科大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。本人离校后发表或使用学位论文或与该论文直接相关的学术论文或成果时，署名单位仍然为山西医科大学。(保密论文在解密后应遵守此规定)论文作者签名：指导教师签名：(本声明日期：趁!竺年—』月—卫日日期：桦年上月早日未经许_uJ，任何单位及任何个人不得擅自使用) 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万方数据人巨细胞病毒PP65抗原ELISA检测试剂的研制摘要目的制备重组PP65多克隆抗体(pAb)，研制检测PP65抗原血症的ELISA检测试剂。方法表达及纯化重组PP65蛋白，考马斯亮蓝法洲定蛋白浓度，WesternBlot鉴定重组PP65蛋白的抗原性。重组PP65蛋白免疫新西兰大耳白兔和SD大鼠，制备相应pAb。间接ELISA测定pAb效价，饱和硫酸铵沉淀法纯化pAb。玻片凝集实验分析pAb与是否与环境微生物发生交叉反应。探索pAb和重组PP65相互结合的各自最佳浓度、最适包被抗体与检测抗体的搭配方案，选择适合的包被温度、包被时问、封闭液以及底物显色时问等，优化检测试剂的条件，建立试剂的检测步骤及PP65抗原标准曲线，并确定试剂精密度及检出下限。通过对101份临床疑似HCMV感染标本的检测，并与市售HCMV_IgM(ELISA)试剂以及HCMV-DNA(FQ—PCR)试剂的检测结果进行比较，分析自制PP65抗原ELISA检测试剂的敏感性与特异性。用自制试剂检测单纯疱疹病毒1型、2型以及EB病毒感染血标本，分析自制试剂是否非特异结合疱疹病毒科其他病毒抗原。检测并分析比较PP65抗原在单个核细胞与多形核细胞中的表达情况。结果纯化得到重组PP65蛋白，蛋白浓度为0．2lmI∥ml。经WesternBlot鉴定，该蛋白可与PP65单克隆抗体特异性结合。免疫所得兔血清pAb效价达1：400000，大鼠血清pAb效价l：20000。玻片凝集实验提示制备的两种pAb均不与环境空气中细菌以及常见葡萄球菌、链球菌、大肠埃希菌反应，说明pAb特异性较高。检测试剂的条件优化，确定了1：2000大鼠pAb为包被抗体，1：20000兔pAb为检测抗体，2％的BSA为封闭液，4℃包被12h，底物显色15min等检测条件，建立了检测PP65抗原血症的ELISA方法和PP65抗原标准曲线。研制所得HCMVPP65抗原ELISA检测试剂的检m下限为5n∥ml，批内精密度与批间精密度均小于10％。自制试剂与市售HCMv-IgM(ELISA)试剂相比检测结果有差别(P<0．05)，与市售HCMV-DNA(FQ—PCR)试剂相比，检测结果无差别(P>O．05)，相对于HCMV-DNA(FQ—PCR)试剂的‘一致率为97．0％。自制试剂对甲．纯疱疹病毒1型、2型以及EB病毒感染血标本的检测结果均为阴性，排除了试剂非特异结合疱疹病毒科其他病毒抗原的可能。经分析PP65抗原在单个核细胞与多形核细胞中的表达量无显著性差异(P>0．05)，提示自制试剂的检测标本取外周白细胞抗原即可。结论建立了检测HCMVPP65抗原的间接双抗夹心ELISA方法，试剂具有较好的敏感性、特异性、稳定性和重复性。 万方数据阳k¨k"jh硕L学位论文关键词人巨细胞病毒；PP65抗原：pAb,ELISATheestablishmentofELISAdetectingHCMV-PP65antigenAbstractobjectiveTopreparetwokindofrecombinantPP65polyclonalantibody(pAblandestablishadouble—antibodysandwichELISAfordetectingtheHCMV-PP65antigenMethodRecombinantPP65wasexpressedandpurified．TheproteinconcentrationofrecombinantPP65wasdetectedbycoomassiebrilliantbluemethod，andtheantigenicitywasidentifiedbyWesternBlot．TherecombinantPP65wasusedtogeneratepAbinNewZealandwhiterabbitsandSDrats，andthetiterofpAbwasidentifiedbyELISA．ThepAbwerepurifiedbyammoniumsulfateprecipitation．CrossreactionbetweenpAbandsurroundingsbacteriawasanalysedthroughglassagglutinationexperiment．TheconditionsofELISAdetectingHCMVPP65antigenwasoptimizedsuchasselectingthecoatingantibody，coatingtemperature，coatingtime，confiningliquid，andthechromogenictime，andSOon，thentheELISAfordetectingHCMVPP65antigenandthestandardcurveofPP65antigenwasestablished．Theprecisionandminimumdetectablequantityofthemethodweredetermined．101clinicalsuspectedspecimenswereexaminedbythismethod．Theresultswerecomparedwiththatoffluorescencequantitative—polymerasechainreactionassay(FQ—PCR)detectingHCMV-DNAandELISAmeasuringHCMV-IgMinserum．HSV-1，HSV-2andEBvirusinfectingsamplesweredetectedbyourmethodforanalysingthespecificity．PP65antigeninPBMCandPMNweredetectedbyourmethodResultThepurifiedPP65concentrationis0．21mg／m1．ThePP65cancombinewithPP65mAbspecificity．ThetiterofrabbitpAbandratpAbare1：400000and1：20000respectively．GlassagglutinationexperimentsuggeststhatthetwokindsofpAbdonotreactwiththosebacteria．1：2000ratanti．PP65pAband1：20000rabbitanti—PP65pAbareusedascoatingantibody(4。C，12h)andsandwichantibodyrespectively．The2％BSAhasbeenfoundastheoptimalconfiningliquid，and15minutesistheoptimalchromogenictime．TheindirectsandwichELISAdetectingHCMVPP65antigenhasbeenestablished．Thecoefficientsofvariationwithinassayandbetweenassaysarealllowerthan10％，whiletheminimumdetectablequantityis 万方数据5n∥m1．ThesensitivityofourreagentishigherthantheHCMV-IgM(ELISA)(尸0．05)．TheconsistentrateofourreagenttotheHCMV-DNA(FQ—PCR)is97．O％．ThedetectionsystemdidnotreactwithHSV-i，HSV-2andEBvirusinfectingsamplessuggestingthatourreagentdonotreactwithotherherpesvirus．ThereisnodifferenceinPP65antigenfromPBMCandPMN(尸>0．05)，itsuggeststhatallleukocyteantigenscanbeusedasdetectingantigenwhenusingourreagent．ConclusionTheindirectsandwichELISAdetectingHCMV-PP65antigenhasbeenestablished，andthereagenthashighersensitivity，specificity，stabilityandrepeatabilityKeywordsHCMV；PP65antigen；polyclonalantibody；ELISA 万方数据ELISAr：Q—PCR缩略词表enzymelinkedimmunosorbentassay酶联免疫吸附试验fluorescencequantitative—polymerasechainreaction荧光定量聚合酶链反应HCMVhumancytomegalovirusHRPhorseradishperoxidaseIgimmunoglobulinIPTGisopropyl—B—d—thiogalactosideKD／kDakilodaltonLBluria—bertainmAbmonoclonalantibodymlnODmillUteopticaldensitypAbpolyclonalantibodyPBSphosphatebufferedsalinePBSTphosphatebuffersolution—-tween·-20PEGpolyethyleneglycolPMSFphenylmethanesulfonyifluoriderpmrevolutionsperminuteSDSsodiumdodecylsulfonatePBMCperipheralbloodmononuclearcellPMNpolymorphonuclearneutrophilIV人巨细胞病毒辣根过氧化物酶免疫球蛋白异丙基一p—d-硫代半乳糖苷下．道尔顿细菌培养基单克隆抗体分钟光密度多克隆抗体磷酸盐缓冲液磷酸盐洗涤缓冲液聚乙二醇苯甲基磺酰氟每分钟转数十二烷基磺酸钠外周血甲．个核细胞多形核中性粒细胞 ————————————————————————————————————————————————————————山上!堕立上_厶羔1堕』二兰生l_!尘万方数据刖舌人巨细胞病毒(humancytomegalovirus，HCMV)属于疱疹病毒科B属双链DNA病毒，是人类疱疹病毒中基因组最人的一种病毒。HCMV可通过口腔、生殖道、胎盘、授乳以及输血或器官移植等多途径在人群传播，而且人是HCMV的唯一宿主。血清学调查表明，60．100％成人有HCMV抗体，其流行无季节性倾向【¨。我国是HCMV感染高度流行的曰家，正常成人HCMV抗体阳性率为76．7％--95．8％121。正常人感染HCMV后，一般没有临床症状，即潜伏感染，产生长期可检测到的lgG抗体，成为病毒携带者。然Inj在一些特殊人群体内潜伏的HCMV可使携带者在特定时期致病。首先HCMV活动性感染是孕妇及新生儿先天性感染最常见疾病，HCMV可以通过母体胎盘侵袭胎儿导致死胎、流产、婴儿畸形及新生儿神经发育迟缓、耳聋、视力低下等先天性疾病及其他后遗症【31。使用免疫抑制剂的患者和艾滋病、器官移植、恶性肿瘤等免疫功能减弱或受抑制的人群中潜伏病毒活动性感染可导致多器官脏器损害的各种临床综合征，如严重并发感染，肺炎、视网膜炎、食管炎、结肠炎和脑膜脑炎等，是患者致死或移植术失败的重要原因。并且有研究显示HCMV感染与人类三大疾病(糖尿病、心血管系统疾病及恶性肿瘤)的发病密切相关14-6]。当机体免疫力低下时，HCMV感染可加重患者原有疾病的症状甚至引起死亡，例如：动脉粥样硬化患者合并HCMV活动性感染是导致细胞内皮受损、冠心病发作的因素之一：③慢性乙型肝炎患者及系统性红斑狼疮患者合并HCMV感染可加重肝功能障碍和系统性红斑狼疮的病情[7-11]。另外，有研究表明HCMV是除遗传因素以外导致先天性耳聋最主要的病原体【12】。综一卜．所述，早期准确诊断HCMV活动性感染对于提前防治相应疾病，减少后遗症的发生具有重要意义。实验室检测HcMV感染可用的方法有：病毒分离培养与鉴定、血清特异性抗体IgG和IgM检测、PCR检测病毒DNA、病毒抗原血症的检测等。病毒分离培养是诊断HCMV活动性感染最直接最特异的方法，但是分离培养受技术方法、实验条件、体外靶细胞状况等的限制，敏感性不高，而且由于HCMV在体外生长速度缓慢，不能满足临床早期快速诊断的需要，故该法主要应用于科研f13】。ELISA检测血清中特异IgG和IgM耗时短，简甲．易操作，{旦IgM抗体因产生早且消失快的特点，仅在感染早期可检测到，并JELHCMV—IgM与‘些其他病毒感染有交义反应，易出现假阳性，造成误诊Il41。此外，免疫功能低下的患者小-Z日、匕E,产生足量IgM抗体或者延迟 ～—————————————————————————————————————————————————————J旦上l坠』∑垒j二业LL!兰生墼万方数据数周产生，所以TgM检测的敏感性不高，特异性也小理想。lgG抗体持续终生，90％1．51,_k的人群因体内潜伏有病e痂]lgO抗体检测结果为阳性。所以TgG抗体阳性只代表曾感染不能说明是活动性感染。PCR因其高度的敏感性使阴性结果对疾病的排除率高而阳性与疾病的相关性低：有报道认为，即使是荧光定量PCR，其敏感性也高于抗原血症的检测力。法fB5№】。过高的敏感性、缺乏统一的临界标准，加之需要荧光定量PCR仪等特殊仪器，不易推广至基层医院。核早期蛋白(IEA)及早期蛋白(EA)抗原血症的检测因病毒的复制可能随时终止在核早期或早期，且lEA及EA在外周血细胞中表达量少，所以低特异性和低敏感性使此方法已很少使用。而PP65抗原血症的检测，是目前广为接受的相对“金标准”f”一t引。这是因为PP65被膜磷蛋白，在不同HCMV病毒株中高度保守，与HCMV活动性感染的特异性高，PP65在被膜蛋白中占95％以上，在受感染者外周血白细胞中检出率极高，故诊断活动性感染，PP65检测的特异性和敏感性均很理想。止ggbPP65检测具有可早期定量等特点，在病毒血症前3—9天【19]，l临床症状前一周即可检出PP65，定量检测PP65可监测疾病的发生发展，判断预后及疗效。但是PP65抗原主要存在于多形核绌胞(PMN)和单个核细胞(PBMC)[20】，需要将细胞固定在玻片上进行荧光免疫组化或酶免疫组化，显微镜下观察计数玻片上着色的PP65抗原阳性绌胞，不仪需要配备荧光显微镜或者配套计算机输出设备和有经验的镜检人员，而且操作繁琐，每个样本需要一个玻片固定检测，不能实现规模化检测。为此，国内个别医院已将荧光免疫组化法改进为流式细胞术检测PP65抗原血症法【2¨，但是仍然离不开流式细胞仪和有经验流武细胞术操作分析人员，难以普及到基层县镇医院，也难以规模化批量检测。建立经济简便地检测PP65抗原血症的ELISA方法，不仅能够早期快速诊断HCMV活动性感染，而且易于普及基层医院，易于规模化操作，并能通过对PP65抗原的定量，判断疾病的顸后和进展、判断抗病毒药物的疗效。本研究通过免疫动物，制备并纯化相应多克隆抗体(polyclonalantibody，pAb)。以pAb为基础材料试制检测H(：MvPP65抗原血症的ELISA检测试剂，意在建立费用低廉、操作简单、快速、灵敏度和特异度较高且易于标准化和规模化操作、易于推广到基层医院的HCMV活动性感染检测方法。 ～万方数据业!坠盟!!尘堕!．望笪堡望第一部分人巨细胞病毒PP65凇删蛋白的原核表达及鉴定材料1．1菌株及相关试剂感受态大肠埃希菌株E．coliMl5、PQE30．PP657戟t质粒由本研究室保存。透析袋购自来宝牛物公司。HCMVPP65单克隆抗体购111VirusysCorporation。1．2主要溶液及试剂配制1．2．1细菌培养用试剂1)LB培养基胰蛋白胨(bacto—tryptone)109，氯化钠(NaC!)109，酵母菌提取物(bacto．yeastextract)59，溶于800mlddH20L}]，摇匀使完全溶解，10MNaOH调pH至7．0，定容至1000ml，高压灭菌处理，4℃保存。2)LB琼脂(Agar)培养基LB液体培养基中加琼脂(Agar)159／L，高压灭菌处理。3)氨苄青霉素(Ampicilin)氨苄青霉素lg溶10mlddH20中，配成100m∥ml储存液，分装，一20。C储存。41卡那霉素(kanamycin)(10mg／m1)溶解100mg卡那霉素于10ml水中，分装，一20。C储存。5)0．5MIPTG0．1909溶于lOmlddH20中，用0．221nn滤器过滤除菌，分装，一20。C储存。1．2．2蛋白质分析用试剂1)30％储备胶溶液：丙烯酰胺(Acr)29．09，亚甲双丙烯酰胺(Bis)1．Og，混匀后加ddH20，37。C溶解，定容至100ml，棕色瓶存于室温。2)1．5MTris—HCI(pH8．8)：Tris18．179力flddH20溶解，浓盐酸调pH至8．8，定容至100ml。3)1MTris—HCI(pH6．8)：Tris12．1lg力HddH20溶解，浓盐酸调pH至6．8，定容至100ml。4)10％SDS：电泳级SDS10．0g力HddH2068。C助溶，浓盐酸调至pH7．2，定容100ml。5)lOx@泳缓冲液(pH8．3)：Tris30．2g，甘氨酸188g，10％SDS100mlJJflddH20溶解，定容至1000ml。 ————万方数据l!!丛堕!：!叁堂型!土堂i!!迨．堡6)10％过硫酸铵(AP)：lgAP)J|IddH20至10ml。7)2xSDS电泳上样缓冲液：1MTris—HCl(pH6．8)2．5ml，p一巯基乙醇1．Oml，SDS0．6g，甘油2．Oml，0．1％溴酚兰1．Oml，ddH203．5ml。8)考马斯亮兰染色液：考马斯亮兰O．25g，甲醇225ml，冰醋酸50ml，ddH20225ml。9)脱色液：甲醇、冰醋酸、ddH20以约3：1：6配制而成。I．2．3WesternBlot检测用试剂1)电转膜缓冲液：甘氨酸2．99；Tris5．89；SDS0．379；甲醇200ml；力HddH20定容至1000ml。2)洗涤缓冲液(PH7．4PBST)：0．15MKH2P040．2g，Na2HP04’12H202．9g，NaCI8．0g，KCl0．2g，Tween一20O．05％0．5ml加蒸馏水至1000ml。3)封闭液：脱脂奶粉59，加入PBS定溶至lOOml。4)显色液：DAB75mg，溶解在100mlPBSqa，临用前加入150plH202。1．2．4蛋白纯化用试剂I)超声缓冲液：PBS63ml，10mg／mi溶菌酶1600pl，100mMPMSF90pl。2)包涵体洗液I：0．5％TritonX一1000．5ml，10raMEDTA4ml，配至200ml。3)包涵体洗液11：10％TritonX一10020ml，10mMEDTA4ml，配至200ml。4)包涵体洗液Ill：10mMEDTA4ml，2M脲24．0249，配至200ml5)8M脲：Nail2P04·2H2015．6g，Tris1．29，脲480．59，溶于1000ml蒸馏水中，NaOH调PH至8．0。6)结合缓冲液：lM“s(pH7．9)1ml，lM咪唑0．5ml，5MNaCl5ml，蒸馏水43．5ml。7)咪唑缓冲液：20mM磷酸钠，500mMNaCl，不同的咪唑浓度。1．2．5蛋白透析用试剂参见表1．1和表1．2。表1．1Laemmli(PH8．3)透析复性配方总体积(m1)Trisbase25mmol／L甘氨酸192mmol／LSDS0．1％5001．5197．2190．59Laemmli(PH8．31透8002．42911．5490．89析复性液10003．03914．42919 万方数据表1．2透析复性液配方1．3主要仪器与设备1)CF一5000板式酶标仪：Bio--RAD公司2)隔水式电热恒温培养箱：上海市跃进医疗器械一J3)7-21分光光度计：上海第三分析仪器厂4)TGL—16C高速离心机：Healfroce5)一80℃低温冰箱：SanyoUltraLawCo6)YXQG01型蒸汽消毒器：山东新华医疗器械厂7)ECP3000三恒电泳仪：北京六一仪器厂8)精密pH计：．卜海市精密科学仪器有限公司9)THZ—C恒温振荡器：江苏太仓实验设备厂10)YJ一875型医用超净台：苏州净化设备公司11)JAl003型电子精密天平：卜．海恒平科学仪器有限公司12)移液器(200—10009l：10一lOOpl：0．5—1091)：eppendorfGermany13)凝胶成像分析系统：VILBERFranch14)TY一808型印迹脱色二用摇床：南达生物技术开发公司15)CSl01电热鼓风干燥箱：重庆四达实验仪器有限公司恒达仪器厂16)MVS—l漩涡混合器：北京北德科学器材有限公司17)OlympusCKX41SF光学显微镜：日本东京Olympus公司 万方数据1．1测序PQE30一pp65重组质粒方法之前已成功构建并冻存于一80。C的PQE30一pp65是携带pp65322．56-基因的质粒，将冻存的PQE30一pp65重组质粒送至上海生ilj测序。1．2表达及纯化重组PP65蛋白1．2．1重组质粒的转化1)无菌状态下，取1pl重组质粒PQE30-pp65加入到100¨l感受态E．coliMl5中，将二者混合均匀后冰浴20rain。2)42。C温浴热击90s，快速转入冰浴环境，冷却2rain。3)无菌状态下，将质粒与感受态的混合物在Amp+／Kan+的LB平板上涂匀，37。C孵育12h。4)挑取单个菌落二F5mlAmp+／Kan+的LB液体培养液中，于摇床中376C，200rpm振摇过夜。1．2．2重组PP65蛋白的诱导表达及表达产物的可溶性分析1)吸取lOOpl转化后的菌液，加入到含25mlAmp+／Kan+的LB液体培养基的大试管中，在摇床中37。C，200rpm振摇过夜。2)从大试管中吸取15ml菌液加入到含有500mlAmp+／Kan+的LB培养液的锥形瓶中，37℃，200rpm振摇2h，取lml菌液于EP管用于后续电泳检测。3)锥形瓶中加入IPTG至终浓度为lmM，37。C，200rpm继续振摇4h诱导表达，诱导后取lml于EP管用二F后续电泳检测。4)将诱导表达的菌液倒入离心管中，4"C，5000rpm离心15min，彻底弃上清。5)加PBS重悬，温和吹打均匀至无团块，于4'C，5000rpm离心15min，彻底弃．}二清。6)加超声缓冲液50ml，吹打均匀后冰浴，进行超声破碎，间隙2s，超声2s，总时长30rnin。7)4℃，5000rpm离心15min，取上清lml于EP管用于后续电泳检测，彻底弃上清，沉淀中加包涵体洗液I重悬，吹打均匀，4"C，5000rpm离心15min。8)取上清lml于EP管用于后续电泳检测，彻底弃上清，沉淀中加包涵体洗液II重悬，吹打均匀，4"C，5000rpm离心15min。 万方数据9)取上清lml于EP管用于后续电泳检测，彻底弃上清，沉淀中加包涵体洗液11l重悬，吹打均匀，4"C，5000rpm离心15rain。10)取卜-清1ml于EP管用于后续电泳检测，彻底弃上清，沉淀中加8M脲，混合均匀，4。C过夜。11)将脲溶解的样品4。C，5000rpm离心30min，取出1ml上清于EP管用于后续电泳检测，其余上清于4。C保存，沉淀保存在一20。C。12)将所自‘留取标本进行SDS—PAGE电泳，分析目的蛋自的可溶性。1．2．3重组PP65蛋白的SDS．PAGE电泳1)样品的制备：将1．2．2中的留取标本中加入等量2×SDS上样缓冲液，混匀，沸水浴5min，使蛋白充分变性，于室温冷却。21上样：将制各好的凝胶板安装至电泳槽中，加入电泳缓冲液，小心拔出梳子，使孔问凝胶整齐，用电泳缓冲液冲洗各个加样孑L，用微量加样器定量吸取变性蛋白样品，加入各个加样孔中。3)电泳：接通电源，浓缩胶电压80V，分离胶电压120V，电泳至溴酚蓝指示剂达凝胶下缘，停止电泳。4)凝胶染色：小心取m凝胶夹板，取下凝胶，置入盛有考马斯亮蓝R一250染色液的玻璃平皿中，盖好平皿，在摇床卜．于宰温染色4h。5)脱色：吸出染液，加入脱色液，室温下振荡脱色，多次换液充分洗脱，直至凝胶背景干净透明，蛋白条带显色良好为止，将凝胶置于蒸馏水中，用凝胶扫描仪扫描电泳图。1．2．4重组PP65蛋白的镍柱亲和纯化1．2．4．1镍柱的处理1)用蒸馏水将柱二f清洗干净后固定在适当的高度，使流出的液体刚好流入放在冰盒中的15ml离心管中。2)将2ml柱料注于柱中，室温静置30min左右。3)将底部开关关闭，加入3倍柱体积的无菌蒸馏水于柱中缓慢贴壁注入，打开底部开关，将蒸馏水缓慢滴出(5s／滴)，滴入上述离一t5管中。4)加入3倍柱体积结合缓冲液平衡树脂，缓慢滴出(5s／滴)，滴入上述离心管中。1．2．4．2目的蛋白的纯化1)将1．2．2．最后得到的上清用0．22微米滤器过滤后缓慢注入柱中，加完样后打开开关，样品流出(10s／滴)，流入新的15ml离心管，柱中样品剩少许时关闭开关再加入样品。 万方数据2)依次加入6倍柱体积的结合缓冲液、洗涤缓冲液、20mM、50mM、100raM、】50mM和300raM的咪唑缓冲液，每一种浓度的咪唑缓冲液穿柱都流入单独的15ml离心管。3)将上述所有离心管中的样她进行SDS—PAGE电泳，确定蛋门的纯化条件。1．2．5重组PP65蛋白的复性和浓缩1．2．5．1透析袋的处理剪好适当长度的透析袋，将其浸在处理液A(终浓度2％NaHC03，1mmol／LEDTAPH8．O)中，煮沸10min，用蒸馏水彻底清洗透析袋；将透析袋浸于处理液B(终浓度1mmol／LEDTAPH8．0)中，煮沸10rain，用蒸馏水彻底清洗透析袋；将透析袋一端系住夹紧。1．2．5．2复性蛋白1)将最适洗脱条件(100mM，150mM，300mM)的咪唑洗脱液在冰浴条件下融化后混合，倒入处理好的透析袋中，然后将透析袋上端加紧。2)将透析袋放入含有6mol／L的透析液的烧杯中，烧杯中放入搅拌子，缓慢搅拌，环境温度为4℃，透析12h。3)弃去6mol／L的透析液，换成2mol／L的透析液，将透析袋置入其中，加入搅拌子，缓慢搅拌，4。C，透析12h。4)弃去2mol／L的透析液，换成Laemmli透析缓冲液，将透析袋置入其中，加入搅拌子，缓慢搅拌，4。C，透析12h。5)弃去Laemmli透析缓冲液，换成PBS，将透析袋置入其中，加入搅拌子，缓慢搅拌，4℃，透析12h。6)将透析袋置于-'Fmt中，用PEG覆盖，待袋中液体剩余2-3ml时停止，分装，一80。C冰箱保存。1．3重组PP65蛋白浓度的测定考马斯亮蓝法检测蛋白浓度。每孔加样量如下表。表1．3考马斯亮蓝测蛋白加样表标准品／样品体积(止)0l234565810PBS体积(gL)15141312111091075考I_§斯亮蓝体积(止)285 万方数据1．4WesternBlot鉴定重组PP65蛋白的抗原性1)SDS—PAGE电泳：将透析后的重组PP65表达样品进行SDSPAGE电泳。2)电转移：剪6张滤纸和一张NC膜，人小与凝胶一样，将NC膜、滤纸和凝胶在电转移缓冲液中浸泡lOmin，从负极(黑孔板)到正极(白孑L板)依次为黑孔板、凝胶支持纤维垫、滤纸、凝胶(’剪掉浓缩胶)、NC膜、滤纸、凝胶支持纤维垫、白孔板，80mA恒流转膜1．5h。3)封闭：将转膜后的NC膜放入装有封闭液的平皿中，室温轻摇2h，中问更换一次封闭液。4)加一抗：弃去封闭液，加入用封闭液1：1000稀释的IlCMVPP65单克隆抗体，置摇床平台，室温温育lh，lOOmlPBST洗涤3次，每次lOmin。5)加二抗：加入用封闭液1：1000稀释的HRP标记羊抗小鼠IgG抗体，置摇床平台，室温温育1h，100m]PBST洗涤3次，每次10min。6)显色：加显色液液，至显色清楚，蒸馏水终止反应。用滤纸吸干膜上残余的液体，保留结果。结果1．1测序结果冻存质粒送．卜-海生工公司测序分析，序列测定结果如下：Ggatcc蛆g烈蛳％lggag哥acaagcc4tacg；gag县￡￡gtgg县翰姆§融量垂熙gg姬量￡gt鹳咖egc地l∽m蚋ga蝈!c98曼鳃￡蟾蚴强叠gcgcggg姓延叠gl然丑g￡gag￡曼鹋￡鼹s￡鲢￡a￡￡每gc￡agtals盥亟壑垦璺旦ggg鳕鲳曼焦gag照鳗胆量跫垦曼蔓烈ggga星昭gc刺朋髂墼g奠Sg鼹鲤gggcg鹪g邸ga￡粤ctggac∞ge994地ggacl?蜡然g；曼g量熙l；垂aj￡蛆鳗ga皇曼gQ辱a名；Sg鳗￡￡gcg蛔璩鳄墼gg鲤gcgccatggcgggcgcc!cc鹳ttccgcgggc￡gc曼a4昭caila地age曼娥蚍gcg§蔓ggc毋g妲cgtsggg!；!gtt；l&a翰cg￡gg曼鳄鳗她垦gg￡曙鱼gl曼蔓a￡哩￡g￡99c￡ga曼gagga嗵鹳g曼Gg星gg量l堑主￡g旦曼璺晏曼g曼垦曼l蚴鞠璺堑曼璺gg曼皤gl堑；曼曼烈gg￡gg￡曼￡蟾g￡agg壁￡gg趔曼￡lgg￡鳗g鳗赆￡tg世gcc￡atggt鹳c坦曙卧蜮喀ggt￡jga酏哄g鳇融熙鳄ga鲤@噬ggg尊籍熙妁￡g；蔓鹏期熙g曼g!啦璺g鱼；g旦；llg雩皿aggc名懊蟾歇99cccgctg《gc4ac蔓￡旦熙c暑蜒g晖g晖aG鳄跹曼鲳鱼鲳鳗照gc鳗ggg姓mg卿￡gc￡霹g旦鲳鳗翰垦靼鲳鳗鳗gaggt蟾8艇￡ga∞曼鲢g地；acttgccgtcatgc!碴ntggc曼量lgg￡嫱l蜡经分析，测序结果与目的片段的序列完全‘致。1．2重组PP65蛋白诱导表达及可溶性分析结果(图1．1)目的蛋白约30KD，如图1．1，脲溶解离心后上清目的蛋白最多，可知目的蛋白富表达 ——．．．————。．．．．．。．．．．—。．．—————————————————————————————————————————————————————————————————————．。．．J!!!i[!—!±—!．．』：!!i．1．j!j：m万方数据J：包涵体th一兰-—_40KC●-_30K[·●●——一4Kli图II重组PP65蛋白诱导表达厦可溶性分析I：诱导前2：诱导后3：超声破碎后离心上清4：包涵体I洗液离心后上清5：包涵体11洗液离心后上清6：包涵体Ⅲ洗液离ttb后上请7：腮溶解离心后上清M：蛋白Marker1．3重组PP65蛋白纯化过程不同阶段的SDS-PAGE结果(图1．2)如吲I2，5个浓度的咪唑s{-均n}|的篮rI，20mM和50mM的咪唑t}l台柏相对较多的Il的蛋rI，"均禽订较引内杂质蛋I。I，100mM，150raM，300mM咪唑-p的口的蛋向量相埘较少，"『尢杂质蛋rI，救选择这-个浓度咪畔一I，的出17I进行复牲。，1一jih?二M■■’●●■●●一■--40KE■一30K[■--24KC围1．2白蛋纯化过程不同阶段的SDS-PAGE结果l：未纯化的样品2：六倍柱体积的结台缓冲液3：ou倍柱体积的洗涤缓冲液4：六倍体积的20ram味唑5：六倍体积的50raM昧唑6：六倍体积的100mM味唑7：六倍体积的150mM味唑8：六倍体积的300mM咪唑9：蛋白Marker ——．，．．，，．．．．．．．，．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．。llll万方数据or}’fl、-。cl!lr-1-m1．4重组PP65蛋白浓度检测结果将纯化蚶的生I’¨¨苟。I斯兜蓝浊测JC浓度，IlI表14u朋『透析浓缩Jj的蛋f，『浓度为O2lm∥mI。表14考马斯亮蓝测重组pp65蛋白¨品1．5WesternBlot鉴定重组PP65蛋白的抗原性(图1．3)纯化复性侨的匝自IPP65生I’IllT以’』PP65-社克隆抗体特异件结合，参见图I3。lM—'I-MMKD．静。∞。●ⅧD围1．3We${ernBlot鉴定t组PP65的抗原性重组PP65M：蛋白Marker ——．万方数据山l!!丝±：}厶堂型!土：￡i!!适塞第二部分PP65多克隆抗体的制备及PP65抗原ELISA检测试剂的研制2．1动物与菌株材料2．50Kg左右的雌性新西兰大耳白兔购自北京军事医学科学院实验动物中心。809左右的雄性SD大鼠由山两医科大学动物中心提供。对数生长期的葡萄球菌、链球菌及大肠埃希菌的菌种斜面和血平板培养基由本实验室提供。2．2主要溶液及试剂的配制1)10×PBS：NaCI769，Na2HP0412．299，KCI1．59，KH2P041．59，加入900mlddH20，充分溶解，调pH至7．4，定容至1000mi。2)包被缓冲液(PH9．60，05M碳酸盐缓冲液)：Na2C031．59g，NaHC032．93g，加蒸馏水至1000ml。3)洗涤缓冲液(PH7．4PBST)：0．15MKH2P040．2g，Na2HP04·12HzO2．9g，NaCI8．0g，KCl0．2g，Tween．200．05％0．5ml加蒸馏水至1000ml。4)封闭液(稀释液)：牛血清白蛋白(BSAl0．1g)JH洗涤缓冲液至100ml。5)显色液A(四甲基联苯胺，TMB)：TMB20mg，无水乙醇10ml，加蒸馏水至100ml。6)显色缓冲液B(PH5．0磷酸柠檬酸)：0．2MNa2HP04(28．4g／L)25．7ml，0．1M柠檬酸(19．2g／L)24．3ml力H蒸馏水50ml。7)终止液(2MH2S041：蒸馏水178．3ml，逐滴加入浓硫酸(98％)21．7ml。2．3佐剂、酶标抗体及其他试剂弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂为SIGMA公司产品，羊抗兔lgG和羊抗大鼠的IgG为EarthOx公司产l口l，牛血清白蛋白(BSA)为BIOSHARP公司产品，96孔酶标板为美国Costar产品。饱和硫酸铵溶液(SAS)：7679(NH4)2S04边搅拌边慢慢加到1000mlddH20，用氨水调节pH至7．0。J-EtaO饱和度为100％的硫酸铵溶液(4．1mol／L，25℃)。其余试剂及仪器同第。部分。方法 万方数据2．1pAb的制备2．1．1免疫动物获取pAb1)免疫前兔耳缘静脉取血1ml，37。C放置30rain，再转入4℃放置待其血块完全收缩，3000rmp离心10rain分离血清，56℃水浴30min灭活补体，分装，置一20。C保存，作为阴性对照。取200pg／ml的重组PP65抗原lml与等体积弗氏完全佐剂混合，吸入5ml注射器中，振荡器上混匀l小时制成乳化剂。皮下及皮内注射免疫已被皮的新西兰大耳白兔，皮下注射乳化抗原400BIt位点，皮内注射50pi／位点。每只兔子背部共免疫8个位点。初次免疫两周后取150pg重组抗原与等体积的弗氏不完全佐剂混合，同样方法再次免疫兔子。再四周后，再次同样方法加强免疫。第三次免疫10天之后，采血分离血清，ELISA检测其效价。2)SD大鼠免疫前断尾采血分离血清保存，初次和再次免疫分别用150pg和100}lg重组PP65抗原，免疫方法同上。2．1．2检测pAb效价1)包被：包被液对倍稀释重组PP65从5l20ng／ml至40ng／ml，50山／孔加入酶标板孔中，置4℃过夜。2)封闭：弃去孔内的包被液，PBST洗2次，拍干，每孑L加loo山封闭液置37。C封闭2h，取m，PBST洗3次，拍干。3)加样：取第3次免疫后采集的血清用封闭液稀释，(稀释度依次为l：1000、l：2000、1：20000、1：200000、l：400000、1：800000、1：1600000、l：3200000)每：fL50pi。1：1000稀释免疫前的相应动物血清为阴性对照，以封闭液作为空白对照，1：1000稀释的抗HCMVPP65币克隆抗体作为阳性对照，37。C孵育lh，PBST洗涤3次，拍干。4)二抗：每：子LsolJl分别加入l：1000稀释的HRP一羊抗兔IgG(用于检测兔pAb)或HRP-羊抗鼠IgG(用于检测鼠pAb)，37。C孵育lh，PBST洗涤3次，拍干。5)加显色液：于各反应孑L中加入显色液A50pl，显色缓冲液B501xl，室温10min。6)终止反应：于各反应孔中加入终止液50pl，观察结果，并测OD450。2．1．3采集免疫血清经间接ELISA检测，证明血清抗体效价达到要求后，心脏采血并分离兔子和大鼠血清。2．1．4纯化pAb使用饱和硫酸铵沉淀法纯化免疫血清，具体步骤如下：1)取4ml血清，加生理盐水4ml，逐滴加入(NH4)2804饱和溶液2ml，形成20％(NH4)2804溶液，边加边搅拌，充分混合后，静置30min。 万方数据2)3000rmp离。tS,20min，弃沉淀，以除去纤维蛋F_l。3)在上清液中再／JIJ(NH4)2S04饱和溶液6mi，形成50％(NH412S04溶液，充分混合，静置30min，3000rmp离·L：,20min，弃}二清。4)于沉淀中力H4ml生理盐水，使之溶解，再加(NH4)2S04饱和溶液2ml，形成33％(NH4)zS04溶液，充分混合后，静置30min。5)3000rmp离-IL,20min，弃上清，除去白蛋白。步骤4～5重复2～3次。6)用2ml生理盐水溶解沉淀，装入透析袋。7)透析除盐，在常温中透析过夜，再在生理盐水中于4℃透析24h，中问换液数次，以纳氏试剂检查NHt(取少量透析液，加试剂l～2滴，出现砖红色即认为有NH4存在)，直至无NH4为止。8)离一tS,去沉淀(去除杂蛋白)上清即为制各好的pAb，间接ELISA测效价，其余分装，一80℃冻存。2．1．5pAb与动物室环境细菌的玻片凝集1)将无菌血琼脂甲板水平放置于动物室动物饲养笼附近地面，开盖暴露空气5min，37。C培养24h，计数茵落并将各菌落通过连续划线法转种血琼脂平板扩大培养24h，刮取各菌菌苔溶于O．5ml含10％甲醛的生理盐水EP管中，制成混合菌液。2)待检兔pAb和：大鼠pAb均用生理盐水稀释成1：l、1：10、1：100、1：1000、1：10000、l：100000和1：200000≥￡7个稀释度。3)洁净玻片划线标记并分成8个区域，灭菌接种环分别取一卜述稀释抗体和混合菌液各两环，于玻片，卜混匀，观察有无凝集颗粒}}{现，同时设立不含抗体的阴性对照，即菌液与生理盐水混合物对照。2．1．6pAb与常见细菌的玻片凝集在葡萄球菌、链球菌及大肠埃希菌菌种斜面．1滴加含10％qa醛的生理盐水5滴冲洗斜面．卜．的菌苔，接种环刮取菌苔至管底生理盐水中，制成相应菌液。其余玻片凝集的操作同2．1．5。2．2试剂条件的优化2．2．1最佳pAb稀释度与最佳PP65浓度的选择根据免疫血清pAb效价ELISA检测结果，选定重组PP65与pAb反应的最佳浓度为1280ng／ml，pAb与重组PP65反应的最佳稀释度分别是兔pAb为1：20000，鼠为l：2000。2．2．2包被抗体的选择 一————．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．—．——．．—————．．．．．．．．．．．．．。．．．．．．—．————————————————————————————————————————————————————!!!j19j!!二!：!—!!：：!：j!!：—!二：』!j!!!型万方数据1)包被：l：20000稀释的兔pAb，50lxiHL，4：c过夜包被酶标板。2)封闭：弃包被液，PBST洗2次，拍干，封闭液1001．d／孑L37。C封闭2h，PBST洗3次，拍干。3)加样：封闭液稀释PP65蛋白至1280ng／mi，50pi／孑L，共加8孔，同时设50pit孑L稀释液阴性对照8-TL，空广1对照8孔，37。C孵育Ih，PBST洗涤3次，拍干。4)加一抗：封闭液稀释鼠pAb为1：2000，50pl／-孑L(空白对照不加)，37。C1h，PBST洗涤3次，拍干。5)加二-二抗：加入l：1000稀释的HRP-羊抗鼠lgG50uIHL(空白对照不加)，37。C1h，PBST洗涤3次，拍干。6)加显色液：于各反应孔中加入显色液A501al，显色缓冲液B50pl，室温10rain。7)终止反应：50uI／孔加入终止液，观察结果，并测OD450。用1：2000醛j鼠pAb包被酶标板，用l：20000的兔pAb作为检测一抗，并将HRP一羊抗兔IgG作为二抗，重复上述实验，比较两种检测体系的特异性。2．2．3包被温度与时间的选择l：2000的鼠pAb包被8条酶标孔(每条8孔)，每两条酶标孔选用一种包被条件，分别是4。C6h和4V12h及37。C2h和37。C4h，检测物即阳性对照样品为1280ng／ml重组PP65抗原，阴性对照样品为封闭液，检测抗体为1：20000的兔pAb，酶标二抗为1：1000稀释的HRP一羊抗兔IgG。比较反应终止后的阳性对照孔OD均值与阴性对照孑LOD均值之差(P-N值】，确定最佳包被温度与时间。2．2．4封闭液的选择为了避免或减少在以后反应中发生非特异反应，酶标板包被完毕后要用惰性蛋白封闭，分别选用2％脱脂奶粉及0．5％、1％、2％的BSA作为封闭液，检测1280n∥ml的重组PP65，依次加-抗、酶标二抗、显色液及终止液，于450nm处测OD值，确定最佳封闭液。2．2．5显色时间的确定在室温下，显色时间分别设为5min，10min，15min，30min，包被温度时间等其他检测条件按一卜述己验证的最佳条件进行，阳性及阴性设置同2．2．3。根据P-N值，确定最适的显色时间。2．3PP65抗原ELISA检测方法的建立根据以上试剂条件的优化实验结果，建立检测HCMVPP65抗原的最适ELISA的反应体系。 万方数据山【坐呸!}厶鲎丝土堂笪迨皇检测试剂的设讨+原理：包被自制人鼠pA卜待榆抗原一自制兔pAb一羊抗兔IgG一底物显色，参见图2．1。酶标羊抗兔IgG自制兔pAb待测PP65Ag自制大鼠pAb图2．1HCMVPP65抗原血症检测试剂原理示意图试剂检测步骤及PP65抗原浓度检测标准曲线的建立：1)包被：用包被液稀释大鼠pAb为l：2000，50pi／孑LDn,,x．酶标板孔中，置4℃过夜。2)封闭：弃去孔内的包被液，PBST洗2次，拍二卜，加封闭液lOOpl／；：jL，置37。C封闭2h，PBST洗3次，拍r。3)加样：封闭液对倍稀释PP65抗原从640ng／ml至10ng／ml，即：640ng／ml、320ng／ml、160n∥ml、80ng／ml、40ng／ml、20ng／ml矛H10ng／ml共7个浓度系列，50lti／；fL分别加样，每个样品重复做2个复孔。37。C孵育Ih，PBST洗涤5次，拍干。4)加‘‘抗：每孔加入50ull：20000稀释的兔pAb，37。C孵育1h，PBST洗涤5次，拍干。5)加二抗：每孔加入50ull：1000稀释的HRP一羊抗兔IgG，37。C孵育lh，PBST洗涤5次，拍干。6)加显色液：于各反应孔中加入显色液A50pl，显色缓冲液B50“l，室温15min。7)终止反应：于各反应孔中加入终止液50111，观察结果，并测OD450。2．4检测体系精密度及检出限的鉴定2．4．1精密度精密度是指用某。‘种检测方法重复分析某+‘特定样品所得的测定值的一致程度。用变异系数(CV)来表示。变异系数CV=(标准偏差／平均值)100％ 万方数据批内变异系数是指一样本在次测定中备个平行样晶之间的变异系数，批间变异系数是指同一样本在不同批次检测时的可重复性。将40ng／ml，160ng／ml，640ng／ml的重组PP65蛋白作为待测标本，每个浓度重复20孔，计算每个浓度测定结果的批内变异系数并分析试剂的精密度。将上述实验每天重复4次，共6天，计算每个浓度的批间变异系数并分析试剂的精密度。2．4．2量怔检出限的确定最低检出限的定义为阴性对照OD均值加3倍标准差。重复检测阴性对照20次，求出OD值的均值与标准差，计算得出最低检出限。2．5统计学方法SPSSl30统计软件分析处理数据，采用两样本t检验的统计方法。结果2．1pAb效价的检测2．1．1兔pAb效价的ELISA检测结果兔pAb效价的ELISA检测结果参见图22，表21及图2．3。田22兔1)岫技价的FI[SA检测 万方数据毫2．1生pAb效价蝴的OD位抗原空白单抗阴性PlP2”P4P5P6P7P8(n#m1)2l581518i主：P1．P8分别代表自制的VeAb的8十稀释座：l：L000、I：2000、l：20000、】：20_D000、】q00000、1：800000．t：1600000、：32000伽。以阴性对照的2倍作为cut-off值，表中P1一P5各OD值均犬于阴性对照的2倍，所以免的pAb效价为1：400000。252孳1．5，。50L帅～m咖_陆皿陆m～岫Ⅲ蟮掣制蚪医兔山的不同稀释倍数如p∞：5i2帆／11口pp∞：256吣，11口pp65：1280r,g／m1●PP∞：翻0r|￡／ml如p舒：越0珥／ll■PP衢：160M／_lOpp齑：80n三，-l■PP晡：qOnU^l圈2．3量pAb效价的ELISA检嗣由表2．I与图2399．当兔pAb稀释度为I：1000与I：2000iFj，OD值总体变化趋势是随着噩组PP65浓度的减少先升高而后又降低：当兔pAb稀释度21：20000时，OD值总体变化趋势是随着重崮lPP65浓度的减少而降低；当兔pAb稀释度为1：200009FJ，所有的OD值都在l0附近：当m组PP65浓度为1280ng／ml时，在荐个兔pAb稀释度中的OD值均较高，所787242405●340342{il1O0O0O048●4402g09＆174I}I!IO0O0O02867432i192；ll2O08270347●0O9O8545432O0O52532384896867565430O0蛇鸵¨粥叭虾舛他69，187852482O99●46422●24O03●56729485●97●O7O3●9●●239，，2lO}O0O蒜嚣篙。。 万方数据以兔pAb与重组PP65f最佳工作浓度为：兔pAb稀释度为1：20000，重组PP65的浓度为1280n∥ml。2．I．2sD大一pAb效价的ELISA檀涓结果大鼠pAb效价的ELISA检测结果参见图2．4，表2．2及图2．5。田24■pAb效价的FIIS^检测囊2．2ItpAb效债拉一的OD值丽原空白单抗阴性PIP2I'3P4P5P6P7P8(ng／m1)往：Pr啊分别代表自制的PeAb的8个稀释度：I=1000、12000、120000、I：200000、1400000、l：800000、1：1600000、I：3200000．以阴性对照的2倍作为cut．Off值，表中P1．P3各值均大于阴性对照的2倍，所以SD大鼠的pAb效价为l：20000。mM弛嚣M蛄拍O0O0m啪啪m⋯晰m啪O0O0253687234l022●0O0O0∞如幢拈∞巧驼观O0O{iO●；j4●0O066●6；99087，96307650O0OⅢ蛳m哪哪耋}州暑骞lOlO0i3530549●4323帅”惦帖够∞"引0O0O083l2l61808095834343叭舱卵引：。"∞跎O0O0O蒜苗翟嚣 ‘彪庞曲一一万方数据罱蕃美i●pp65：5120rig^1口pp舔：箍6嘶2^】口PP65：128Gng／=l■pp西：幽0n￡／虹■pp衢：弛0ng／m1mpp衢：160n2／d口pp晡：80n—al■pp晒：40n∥^1田2．5■pAb效价的ELISAIl■由表22与圈25可见，当鼠pAb稀释度为l：1000。OD值无明显变化趋势；当鼠pat,稀释度三l：2000时，OD值总体变化趋势是随着重组PP65浓度的减少而降低；当鼠pAb稀释度为1：2000时，所有的OD值都在10附近：当重组PP65浓度为1280ng，ml时，在各个鼠pAb稀释度中的OD值均较高，所以鼠pAb与重组PP65堆佳工作浓度为：鼠pAb稀释度为1：2000，重组PP65的浓度为1280ng，ml。2．1JpAb与绷■的藏片鼍囊血琼脂平板暴露动物饲养室5分钟后培养得N4个苗落。动物室空气中细菌的混合菌液和常见的葡萄球苗、链球菌及大肠埃希菌的菌液与不同稀释度的兔pAb和大鼠pAb均无凝集颚粒出现，与阴性对照无区别，参见图26，说明在免疫动物制备多抗过程中，虽然动物处于可接触多种微生物的环境中，但是所得pAb并不与这些常见微生物发生特异结合反应，提示所制备的pAb特异性较高。800品n一霍QX§—2 万方数据田2．6蓝灌与¨铀玻片凝羹实验结果2-0至2-7分别是动袖宣空气中细蕾的混合■液与生理盐水对照．以噩与I：I、I：IIl、I：II)Il、I：1000、I10000、I：InIlImo和I：200000共7个稀释度兔pAb反应的玻片凝集结果。田示与2-0的阴性对照一样均无凝羹现量，2．2试剂条件的优化22I包被抗体的选择兔pAb为包被抗体时，阴性对照呈淡黄色，OD值的均值为O569，大鼠pAb为包被抗体时，阴性对照几乎呈无邑，其OD均值为0122，兔pAb包被酶标板所得阴性对照的OD均值远高于鼠pAb包被，两者OD均值相比差异显著(P<005)参见图27，而阳性对照的OD均值．前者低于后者(R005)；空白对照的OD均值，无显著性差异(尸>005)。所以包被抗体应选择SD大鼠pAb，而检测抗体选兔pAb。1·j暑10．j0r—t———————一■oj■—一●⋯●⋯．-●●．．．●．．．一￡_={_=1}?—-h⋯!．t●■134j6i孔位田27不同I，～b包被酶标扳所得OD值2．22包被温度与时间的选择●．空白(兔p^h乜梭)^t阳性对照(兔p曲乜艟●·阴性对照(兔p曲乜镳—·一主自(鼠D^b色饺)十阳性对照(鼠pAb乜棱+阴性对照(n口曲色键 万方数据当包被温度为4。C、包被}l,JI"J为12h时，所得fP—N1最高，且重复性好，结果见表2-3。表2．3不同包被温度与时间组阳性与阴性对照的OD差值2．2．3封闭液的选择当使用2％的BSA封闭酶标板时，P-N最高，且明显高于未封闭时的P—N，所以选择2％BSA做为该体系的封闭液，参见图2．8。未封闭2．0％BSA1。0％BSAO．5％BSA2％脱腊奶粉00．20．40．60．811．2王．41．61．82P—N图2．8不同封闭液封闭包被板所得∞值2．2．4显色时间的确定当显色时问为15min时，P．N值最高，故设定显色时间为15min。参见表2．4。表2．4不同显色时间的P．N值2．3PP65抗原ELISA检测方法的建立建立的PP65抗原ELISA检测方法对640ng／ml、320ng／ml、160ng／ml、80ng／ml、40ng／ml、20ng／ml和10ng／ml共7个重组PP65抗原系列浓度进行了检测，得到检测PP65抗原浓度的标准曲线，回9一方程为y=0．31791n(x)一0．473l，R2=0．9894，如图2．8，说明检测的OD值与PP65抗原浓度有良好的相关性。 万方数据王．Sl，6王．{王O。S0．60．毒O．2OlO100Pl’65(np,／m1)i000图2．8重组PP65抗原标准曲线2．4检测体系精密度及检出限的鉴定2．4．1精密度将40ng／ml，160ng／ml，640ng／ml的重组PP65蛋白作为待测标本来检测，计算批内及批间变异系数结果分别见表2．5及表2．6。由表可知，批内变异系数介于39—6．1％之间，批问介于4．2．6．7％之间，均小于10％，说明检测体系稳定，有良好的重复性。表2．5检测体系批内精密度分析2．4．2最低检出限的确定经重复检测阴性对照20次，得m其OD值的均值与标准差，并计算得卜h最低检}n限的OD值为0．156，此OD值对应重组PP65的浓度为5ng／ml。所以本试剂对PP65抗原的最低检出限是5ng／ml。如果将HRP一羊抗兔标记系统改为生物素亲和链霉素酶标(BSA)系统，则试剂的敏感性可望进一步提高。 ——————————————————————————————————————————————————————————————————————jD』I』!』±J∑j!!Ⅱ：L：￡』i，i．＆—塑万方数据第三部分HcMVPP65抗原ELISA检测试剂的应用材料ELISA检测HCMV-IgM试剂为意人利DIA．PRO公司产品，FQ—PCR检测HCMV-DNA试剂由中山医科大学达安基因诊断中心提供。患者血样由山两省妇幼保健院(山西省儿童医院)、山西医科人学笫一附属医院、山西人医院和山西省第二人民医院提供。其它试剂与仪器同第‘部分和第二部分。方法3．1检测标本的收集与处理3．1．1临床标本的收集临床HCMV活动性感染诊断需实验室检测结果支持且同时具备以下症状之一[22】：①发热，体温大于38。C，持续3天以卜I；②无痰性咳嗽、胸闷、紫绀或呼吸困难、唇面发绀及低氧血症(向．氧饱和度小于80％)；③胸片乱问质性肺炎表现；④肝功能异常(排除传染性肝炎和药物性肝损害)；⑤关节痛；⑥胃肠道溃疡、出血等。对具备上述临床表现一项以卜的10l位临床入选患者，分别采集其抗凝血标本与非抗凝血标本各1份，共收集标奉202份。3．1．2非抗凝血标本的处理将非抗凝血标本在常温离心机中离心3000rpm，15min，取血清于EP管中，置-20。C冰箱待检。3．1．3抗凝血标本的处理1)取新鲜抗凝血2ml于15ml离心管中。2)加蒸馏水至15ml，I?下翻转混匀10次，静置5min，常温3000rpm离心15min，彻底弃卜-清。3)加蒸馏水2ml悬浮细胞。4)重复步骤2和3，直至彻底破坏红细胞。5)加生理盐水适量(约20091)使白细胞浓度为105／ml左右，转移白细胞至1．5mlEP管。6)在冰浴环境下超声提取白细胞核内抗原，每超声2s问隔2s，共超声99次，或者反复冻融裂解细胞法提取抗原。 ——．．．．．．．．．．，．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．，．．．．．．．．．．．．．．．．，．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．!j．!．!!!：lj：!：：．：[：j：．：!：：．：．!：：：!!!!．．：!：：：．』：：．!．：!型万方数据7)3000rpm4。C离心I5rain，转移L清液至干净EP符即为F1细胞核内释放的待检抗原，一20℃冰箱保存待检。3．2临床标本的检测3．2．1FQ．PCR检测HCMV-DNAFQ—PCR检测血清标本中HCMV-DNA，详细操作步骤按说明书进行。3．2．2HCMV-IgM的检测ELISA检测血清标本HCMV-IgM，详细操作步骤按说明书进行。3．2．3待测抗原标本加样稀释度的确定选择三份HCMV-DNA与HCMVqgM均阳性患者的待检抗原标本，各标本原液加样两孔，1：10稀释加样两孔，l：100稀释加样两孔，l：1000稀释加样两孔，其余检测步骤同第二部分方法2．3PP65抗原ELISA方法的建市，分析结果，确定最适加样稀释度。3．2．4自制试剂对待检抗原标本的检测根据3．2．3的结果选择待柃抗原标本的原液进行检测，101份标奉均做2个复孔，其余操作步骤同第二部分方法2．3PP65抗原ELISA方法的建赢。3．3单个核细胞与多形核细胞中PP65抗原含量的比较选3．2．4中检测阳性的5例患者，再次抽取抗凝血，淋巴细胞分离液分离m单个核细胞，同时吸取多形核细胞层，3．1．3的方法提取多形核细胞核内抗原。单个核细胞核内抗原的制各同3．1．3步骤5)至7)。单个核细胞与多形核细胞的待测PP65抗原标本均加样两孑L进行检测。3．4自制试剂特异性的鉴定对临床检测为中．纯疱疹病毒l型、甲．纯疱疹病毒2型、EB病毒感染为阳性的患者，各收集5例患者的抗凝血标本与非抗凝血标本，用3．2．1和3．2．2的方法检测血清中HCMV-DNA和HCMV-IgM，用自制PP65抗原ELISA检测试剂检测白细胞核内PP65抗原。3．5统计学方法两种试剂的检测结果比较采用配对四格表资料的X2检验的统计方法；同一样本中，单个核细胞与多形核细胞中PP65含量的比较采用配对t检验的统计方法。 ——万方数据⋯凸l!二!：}叁：!塑土堂i!!堡望结果3．1待测抗原标本加样稀释度的确定同～样本在原倍(即未稀释)加样时，OD值最人，且OD值随着稀释度的增人而减小；不同样本在原倍加样时，OD值差异最大，且OD值的差异随着稀释度的增大而减小，参见图3．1。故选择原倍样本作为加样浓度。甍硅赫图3．1样本加样稀释度的确定3．2FQ．PCR检测HCMV-DNA与自制ELISA检测HCMV-PP65的比较FQ—PCR检测lOl位疑似HCMV活动性感染患者的血清HCMV-DNA，自制ELISA试剂检测同‘患者白细胞抗原标本中的HCMV-PP65抗原，结果阳性例数分别是26例和25例，详见表3．1。表3．1FQ—PCR检测HCMV-DNA与自制ELISA检测HCMV-PP65检测结果分析S6毒2iS64：OlO培^lf' ————————————————————————————————————————————————————』旦坠竺I兰』二王坐LL』尘■竺羔万方数据灵敏度朋来衡量菜种试验检出有病崭的能力，是将实际有病的人正确判定为真附眭的比例。在本试验中，HCMV-PP65(ELISA)相对于HCMV-DNA(FQ．PCR)的灵敏度为--a／(a+c)x100％=24／26×100％=92．3％。假阴性率是将患者错误地判定为无病的比例(1一灵敏度)。在本试验中，HCMV-PP65(ELISA)JFH对于HCMV-DNA(FQ—PCR)的假阴性率为7．7％。特异度足衡量试验正确地判定无病者的能力，是将实际无病的人正确的判定为真阴性的能力。在本试验中，lqCMV-PP65(ELISA)相对于HCMV-DNA(FQ—PCR)的特异度=d／(b+d)x100％=74／75x100％=98．7％。假阳性率是将允病者错误地判定为患者的比例(】一特异度)。在本试验中，HCMV-PP65(ELISA))Fg对于HCMV-DNA(FQ—PCR)的假阳性率为1．3％。两种力1法检测的。‘致率为97．O％，两种试剂的检测结果无差别，P>0．05。3．3HcMVIgM的检测结果与重组PP65ELISA检测结果的比较ELISA榆测101位疑似HCMV活动性感染患者的血清HCMV-IgM，自制ELISA试剂检测同一患者白细胞抗原标本中的HCMV-PP65抗原，结果阳性例数分别是18例和25例，详见表3．2。表3．2HCMVIgM与HCMVPP65抗原检测结果分析HCMV-PP65(ELISAl与HCMV-IgM(ELISA)对10l例疑似患者检测的一致率为91％，两种检测结果有差异(尸0．05，参见图3．2。 万方数据0．50l2唾5口PBMClP即NS图3．2同一样本中单个核细胞与多形核细胞PP65抗原含量比较3．5自制试剂特异性的鉴定用自制试剂分别检测单纯疱疹病毒1型、单纯疱疹病毒2型、EB病毒感染阳性标本，结果均为阴性，与市售FQ．PCR试剂检测HCMV-DNA，市售ELISA检测HCMV-IgM的检测结果一致，说明自制HCMVPP65抗原ELISA检测试剂与疱疹病毒科其他病毒抗原无交叉反应，说明白制试剂的特异性较好。讨论讨1忿抗原与弗氏佐剂混合为胶乳状态的方法有多种，比如管道相连的两注射器来同推拉法、小电钻混合法、超声波混合法、漩涡器震荡混匀法等；各种方法都可以得到满意的胶乳状态混合物(判断标准：在玻片．卜．滴‘滴约lcm×1cm的水滴，将309]胶乳混合物小心滴在水滴卜|，10min内，蛋白抗原与弗氏佐剂不分开，即不出现水油分离的现象)。推拉法阻力大、易崩开、蛋白浪费较多：小电钻混合法需要小电钻的功率足够大。本研究选择了将抗原蛋白与弗氏佐剂抽入注射器，置于漩涡混匀器．}二混匀45min的方法，也得到了充分混匀的佐剂乳化抗原。结构蛋白PP65的编码基因HCMVUL83位于119352～121037(互补链)，全长1686bp，编码561个氨基酸。本研究选择包含优势T细胞表位和B细胞表位的PP65第322到561位氨基酸【23】对应的第976—1686位核苷酸片段，进行PCR扩增和原核表达PP65322．651蛋白片段。选择原核表达PP65蛋白是因为PP65蛋白是磷蛋白，而非糖蛋白，在缺乏糖基化功能的原核细胞内即可以允分表达得到活性蛋白片段。结果证明获得了具有免疫活性的PP65蛋白片段【231。 万方数据抗原的pAb是针对此抗原多个不同表位的抗体的混合物，因此pAb中的各抗体均能与此抗原起反应，只是针对的抗原决定簇不同；单克隆抗体(mAb)是单纯针对抗原上的某一抗原表位的纯抗体，因此，【j能弓抗原上其相应的表位起结合反应，旦此表位变异、表位暴露不足，或表位数量过少，则结合反应微弱，检测结果可能阴性。所以在抗原检测力+面，mAb的特异性高，但灵敏度不及pAb，容易造成假阴性。如果用mAb作为抗原检测的试剂成分，一般需要至少2种单抗混合应用，以尽量避免其敏感性低的缺点，尽管如此其结合抗原的敏感性仍然不及pAb。但是由于pAb制备过程中免疫动物接触环境中微生物等多种抗原，其所含抗体成分可能较为复杂，作为检测试剂成分，其特异性不如mAb，容易结合待检抗原以外≥￡他抗原成分。为此，本研究采用多次反复免疫动物以获取高效价多克隆抗体(经检测抗体效价高达1：400000)，并将制备的pAb与动物饲养环境中的绌菌以及实验室保存的生活中常见细菌进行了玻片凝集实验，排除了所制各pAb非特异结合这些细菌的可能。据此，没再进行常见抗原吸收多克隆抗体以去除非特异抗体的实验步骤。此外，既能够感染兔子和大鼠，使之产生相应抗体，又能够感染人类，并且相关抗原可存在于人外周血白细胞的病原体种类很少。HCMV只感染人类，但是与HCMV同一病毒科的单纯疱疹病毒宿主范围较广，并且也是双链DNA病毒，核内复制装配，为此本研究用制备的试剂检测了单纯疱疹病毒1型，2型感染者白绌胞超声抗原，同时检测了疱疹病毒科感染率高、容易长期潜伏B绌胞的EB病毒感染标本，结果均为阴性。说明所研制的检测HCMVPP65抗原的ELISA试剂特异性较高，不与疱疹病毒科其他病毒抗原发生交叉反应，更肯定了试剂的特异性。同时也提示奉研究所选择的PP65，zz．56-蛋白片段是HCMV所特有，不与疱疹病毒科其他病毒存在共同表位。将101份临床疑似HCMV感染患者的血清分别用FQ—PCR试剂(中山医科大学达安基因诊断中心)和IgM试剂(意大利DIA．PRO公司)检测，同时用本研究试剂检测患者外周白细胞PP65抗原。结果本研究的敏感性远高于HCMV-IgM(ELISA)试剂；木研究相对HCMV．DNA(FQ．PCR)试剂的敏感度为92．3％，特异度98．7％，由于HCMV—DNA(FQ—PCR)检测试剂存在着敏感性过高的问题，所以本发明实际敏感性和特异性可能更好。由于检测PP65抗I氧的免疫荧光进口试剂贵，检测步骤繁琐，国内很少应用这种既敏感义特异的试剂，所以未将本研究自制检测试剂与PP65抗原免疫荧光检测试剂进行比较。 ———————————————————————————————————————————————————————旦坐堕堡丛±尘二上堕LLjl兰!￡—生万方数据本研究的捡洲方法批内变异系数介丁3．9—6．1％之问，：tl：tl司介丁4．2—6．7％之问，均小于常规10％的限制，说明检测体系稳定，有良好的重复性。本检测方法对PP65抗原的最低检出限是5ng／ml。此外，利用本方法比较了l例使用免疫抑$Iii的肾移植患者更昔洛韦治疗前与治疗2周后的HCMVPP65抗原的量，由194ng降低到15ng，证明了本方法具有监测药物疗效的作用。关于HCMVPP65抗原血症的检测标本，有报道检测多形核细胞中的PP65抗原【2钔，也有检测单个核细胞中的PP65抗原f251，用本研发试剂分别检测同一份血标本中外周血多形核细胞和单个核细胞的PP65抗原，检出量无差别(尸>0．05)，提示用自制试剂检测PP65可直接裂解红细胞获得白细胞后超声处理获得抗原即可检测。本研究检测方法具有较好的特异性、敏感性、稳定性和可重复性，不仅能够经济简便地早期快速诊断HCMV活动性感染，而且易于普及基层医院，易于规模化和标准化操作，并能通过对PP65抗原的定量，判断疾病的预后和进展以及抗病毒药物的疗效。结论1．制备了两种高效价pAb，1：400000的兔pAb和l：20000的大鼠pAb：2．成功研制了检测HCMVPP65抗原的间接双抗夹心ELISA试剂：3．试剂具有较好的敏感性、特异性、稳定性和可重复性。参考文献[1】RedelaHoz，GStephens，andCSherlock．DiagnosisandtreatmentapproachesofCMVinfectionsinadultpatients．JClinVirol，2002，25(8)：S1～12[2】赵捷，闻良珍，张桂梅．人臣细胞病毒蛋白pp65诱导特异性免疫应答的研究．医学分子生物学杂志，2008，5(2)：137～140[3】DiejomaohMEAI_-AzemiM，JirousJ,eta1．Theaetiologyandpatternofrecurrentpregnancyloss．JObstetGynaecol，2002，22(1)：62--67【4]高阳，李震中，何俊瑛，等．急性缺血性脑血管综合征患者颤动脉粥样硬化斑块类型与巨细胞病毒激活感染的相关性分析．脑与神经疾病杂志．2008，16(3)：173--176【5]Robe,sBW,CechI-Associationoftype2diabetesmellitusandseroprevalenceforcytomegalovirus，SouthMedJ，2005，98(7)：686～692【6]AdaniGL，BaccaraniU，LorenzinD，eta1．RoleofcytomegalovirusandEpstein—Ban-virusin 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万方数据·综述·人巨细胞病毒研究概述人巨细胞病毒(humancytomegalovirus，HCMV)属疱疹病毒科D属双链DNA病毒，是人类疱疹病毒中基因组最人的一种病毒。血清学调查表明：60％～100％成人有HCMV-IgG抗体，其流行兀季节性倾向f11。我幽是HCMV感染高度流行的国家，正常成人HCMV-IgG抗体阳性率为76．7％一95．8％【21。虽然HCMV感染非常普遍，但绝大多数为潜伏感染。该种感染状态对健康个体的危害一般察觉不到，而对于免疫功能低下的患者如肾脏移植以及AIDS患者，会形成严重甚至是致死性的危害【3l，并且HCMV活动性感染是孕妇及新生儿先天性感染最常见疾病之一。因此人巨绌胞病毒感染的研究引起了广泛的关注。本文就HCMV与机体的相互作用、HCMV所致疾病、HCMV的检测力‘法及HCMV的疫苗研究进行综述。HCMV与机体的相互作用T淋巴细胞、自然杀伤细胞(naturalkillercell，NK)巨噬细胞、干扰素以及病毒中和抗体、均在抗病毒过程中发挥重要作用。具有杀伤作用的T淋巴细胞可识别病毒感染绌胞，通过裂解受感染细胞或诱导绌胞凋亡等方式达到清除病毒的目的。HCMV要想在机体重重防御机制中生存下来，就需要一一攻破其障碍。HCMV病毒基因组除编码其形成完整病毒颗粒所必需的结构蛋白外，尚且编码一类免疫调节因子(immunemodulationfactor)，参与调控宿主细胞功能及免疫反应的重要调控节点。HCMV选择性的对机体免疫调控网络中的重要节点产生干扰机制，破坏机体的免疫防御功能。HCMV改变宿主基因如编码趋化因子、趋化因子受体等免疫分子的类似物的基因，捕获宿主蛋白，下调或抑制相关免疫调节因子等作用足HCMV与机体斗争的主要方式。为了在宿主体内建立持久性的感染，HCMV形成了’个复杂而精细的免疫调控网络【41。HCMV的US2一USll基因编码的糖蛋白分子可卜调MHC—I、MHC—II类分子的表达。病毒的编码蛋白US2、US6和USl1可使MHC—I类分子的重链从细胞内质网中脱落，并将其转运至胞浆为蛋白酶所降解。现已发现Glni92和Glyi96是USl1行使其免疫逃避功能的关键位点[5。8]。为了逃避NK细胞的非特异性杀伤作用，HCMV基因组中存在多个基因位点(ULl6、ULl8、UL40、UL83、ULl41、UL42)编码特定的免疫调节分子，抑制NK细胞识别和杀 万方数据伤受感染细胞[9—131的功能。HCMV如同≥0他疱疹病毒⋯样，利用Fc受体来躲避中和抗体的识BIJ[,,1。HCMV在感染宿主细胞后，能够编码产生Fc—Y受体[14-17}以及Fc类似物(虫¨TRLI!／IRLlK、u1119／118)㈣竞争性结合IgG的FcI墨域，隐藏抗体识别部位，保护病毒感染细胞免受抗体介导的细胞毒作用。病毒干扰宿主免疫反应最直接的方式就是编码在机体免疫反应过程中起关键作用的细胞因子、趋化因子及相关受体的类似物，同时通过“捕获”宿主基因来靶向调控特异性的免疫通路，HCMV编石『5一类具有免疫调控活性的细胞因子vIL一10【驯。对HCMv临床分离病毒株的研究发现，病毒UU44基因编码一类胞膜受体TNFR(tumornecrosisfactorreceptor)类似物，该受体可能参与病毒侵入宿主细胞的过程[19-2⋯。HCMV编码的即刻早期蛋白lEl和IE2能够结合STAT2转导通路中的转录激活因子，抑制核转录凶子(NFkB)的活性，从而下调IFN在HCMV感染细胞中的表达[21-22】。HCMV的衣壳蛋白PP65(UL83)在病毒感染早期能够抑制IFN基因的转录活性，并与病毒IE2基因的表达密切相关【2引。蛋白激酶R(proteinkinaseR，PKR)是南干扰素诱导产生的一类具有抑制病毒蛋白合成作用的酶类，PKR可被HCMV基因组瓦补DNA的转录中问产物dsRNA激活，HCMV通过编码TRSl和IRSl蛋白，结合病毒自身的dsRNA，使PKR的活化途径受损，抑制其抗病毒作用[24-25】。HCMV通过编码自身的趋化因子(vCKR)及趋化因子受体(vCKRs)或分泌趋化因子结合蛋白(vCKBPs)来干预宿主的趋化因子网络【261。HCMVULl46基因编码。‘类CXC趋化因子的类似物(vCXCLI1，这类病毒蛋白不但能够激活中性粒细胞，还_丌j‘通过与CXCR2受体结合趋化或活化受病毒感染细胞，同时趋化白细胞及造血细胞向感染部位聚集，引起病毒扩散及潜伏感染【z71。HCMV可使机体处于广泛的免疫抑制状态，在器官移植和干细胞移植患者中发现，HCMV的活跃感染增加了机体继发细菌和真菌感染的风险陋29】。事实I：，体内外的研究均表明HCMV的感染与人体免疫功能受损密切相关[30-31】。HCMV成功改变了机体的免疫反应过程，并在人体建立了长期持久甚至是终身感染，HCMV和宿主免疫相互作用的过程最终使两者均得以生存(mutuallyassuredsurvival)1321。HCMV所致疾病HCMV感染机体后，般潜伏在机体中，不致病，但当机体免疫系统发生改变时，HCMV继续复制，从而使机体致病。HCMV病诊断标准【33】包括：①发热，体温>38。C， ——．．．．————————————————————，，—，，．．．．．．．．．．．．．．．．．．．。．——————．．．．——————————————，．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．，．．．，．．．．．．．．．．．．．．!j．1j!j!．}!：．．!．j．。：：：．：』：：j!!!．：』：．：．￡j：ji!盟万方数据持续3天以上：②无痰性咳嗽、胸闷、紫绀或呼吸困难、唇面发绀及低氧血症(血氧饱和度<80％)；③胸片有问质性肺炎表现：④肝功能异常(排除传染性肝炎和药物性肝损害)；⑤关节痛：⑥胃肠道溃疡、出血等。具备上述临床表现-一项以上，排除其它微叶：物或病原体感染后，且实验室HCMV-Ag检测阳性和／或HCMV-DNA(FQ—PCR)阳性口J．以诊断为HCMV病。HCMV的全身性感染可表现为多系统、多脏器损害，宫内感染忠儿可出现中枢神经系统(发育迟缓、小头畸形、脑室钙化等)、听力(感音神经性耳聋)、视力(脉络膜视网膜炎)等损害，婴幼／LN以巨细胞病毒肝炎和肺部感染常见【，剖。移植物抗宿主病(GVHD)是器官移植咱勺主要障碍，HCMV感染可以诱导GVHD的出现【s5-361：HCMV感染还可影响移植后免疫耐受的形成，引起问质性肺炎，是继发fIfl霉菌感染的高危因素，易并发细菌、真菌、原虫等混合感染，从而造成移植失败[37-39]。HCMV感染对于早期器官移植受者的威胁极大，在使用免疫抑制剂的移植受者中，病毒复发和初次感染占60％～70％1401。某些肿瘤如宫颈癌、结肠癌、前列腺癌、Kaposis肉瘤中，HCMVDNA及抗原有较高检出率【411。自1985年Fabricant等报道用禽类疱疹病毒诱发火鸡冠状动脉硬化成功以来，随着研究的深入，HCMV感染与动脉粥样硬化相关关系已得到广泛证实1421。如潜伏在血管壁内皮细胞中的HCMV，由于免疫损伤等作用，致使血管壁受损硬化蚓。HCMV的检测方法病毒分离培养、血清特异性抗体IgG和IgM检测、DNA的PCR检洲、抗原学检测等方法是可用于HCMV实验室检测的方法。病毒分离培养是诊断HCMV活动性感染最为特异的方法，但由于HCMV在体外生长速度缓慢，检测时间长，不能快速确诊以满足临床需要，故该法丰要应用于科研1441。用ELISA法检测血清中特异的IgG幕[1lgM，耗时短，简译易操作。但因隐性感染的正常人体内也可检测到IgG，故IgG的检测仅作为HCMV活动性感染的辅助检查。免疫力正常的人群感染HCMV后HCMV．IgM可在3—5天出现，但对于缺乏免疫力或免疫力低下的人群，HCMV．IgM会延迟出现，有的数周才能m现，因此而HCMV—IgM的检测不能客观反应病人的感染情况，fiHCMV—lgM与，‘些病毒感染有交叉反应，易造成误诊【451。PCR检B,!JHCMV—DNA对HCMV活动性感染的敏感性高，但是特异性低，随着科学技术的不断发展，敏感性和特异性均较好的荧光定量PCR更具有临床应用价值。有文献报道[46-471其敏感性明显优于定性PCR和抗原血症的检测方法。但由于检测费用贵，定量标准不统‘，需要配套的特殊设备，敏感性高而特异性较低等因素，FQ—PCR的推广应用遇到了瓶颈。 万方数据PP65蚩F1抗原血症的检测因其高度的特异性和敏感性f。8491是H前诊断HCMV活动性感染的相对“金标准”[50-51】。此外PP65检测具有可甲^期定量等特点，在病毒血症前3—9天，临床症状前一周即可检出PP65，定量检测PP65抗原町监测疾病的发!L发展，判断预后及疗效。HCMVpp65基因作为一个早晚期基因在感染周期的早晚期均有表达1441。PP65蛋白为HCMV主要被膜磷蛋白，属丁|低基质磷酸化蛋白，占被膜蛋白致密颗粒的95％，占整个病毒蛋白的l5％，分子量为65kD。HCMVADl69株的标准序列中，结构蛋白PP65的编码基因HCMVUL83位于119352～121037(互补链)，全长1686bp，编码561个氨基酸，而且在不同HcMV病毒株中，pp65基因具仃高度的保守性和免疫优势。PP65抗原血症检测方法是应用PP65蛋白的抗体检测人外周血白细胞中的PP65蛋白，通过免疫组化技术、免疫荧光技术进行检测，计数着色的PP65抗原阳性细胞，判定机体HCMV的活动程度【钔。目前国外普遍采用此力‘法诊断活动性HCMV感染，但由于进口试剂价格昂贵(尚无相应匡I产检测试剂)加之操作繁琐，国内仍以定量PCR检测病毒核酸和检测血清IgM抗体为主。国内个别医院已经开展流式细胞术检测PP65抗原血症检测法。但是需要流式细胞仪和有经验的检测人员。研发敏感又特异，可快速、准确、廉价又易于推广的人巨绌胞病毒感染检测方法，是HCMV感染诊断的研究方向之一。HCMV的疫苗研究进展HCMV疫苗的研究已经30年有余了，但至今仍未有疫苗获准卜-市。目前处于研究阶段的疫苗主要有减毒活疫苗、亚单位疫苗、多肽表位疫苗和其他疫苗。减毒活疫苗是最早研究的疫苗，虽然有‘定的免疫作用，但还是不能很好的防止感染。亚单位疫苗的研究已明确gB和gH是诱导中和。11抗体的主要靶蛋白(gB和gH分别是病毒膜糖蛋白glycoproteinB和H)，PP65是诱导CTL活化的主要蛋白，gB和PP65亚毕．位疫茁的相关文献多不胜举。但是gB亚单位疫苗存在抗体响应时间短，且不能确定具有预防小同HCMV株感染的功能，而PP65亚甲．位疫苗能否预防病毒再激活还不能确定，能否预防感染也有待证实。其他疫苗也都因为一些自身原因而不能应用于临床。SchleissMR总结目前研究进展时提m了以下几个关键未解决问题[5H：(1)宿主相关保护性免疫未明；(2)疫苗应涵盖蛋白不明；(3)临床目标局限：目前临床疫苗实验主要集中于免疫低下患者，而该类疫苗可能并不适用于先天性感染；(4)适合接种HCMV疫苗的人群需要明确。KhannaD2]认为分别研制降低发病率和疾病控制的疫苗以及避免感染的疫苗，将使疫苗研究更趋现实，也更有望造福人类，降低相关疾病带米的健康费用。当然，正如SchleissMR所述【51|，加强相关宣传教育，尤 万方数据}ol一；{}人’#坝l+学付沦卫』0足在育龄女性中的宣传和教育11J．能是提i哥预防效果，降低HCMV对人类危害的重要措施之一。参考文献【1]RedelaHoz，GStephens，andCSherlock．DiagnosisandtreatmentapproachesofCMVinfectionsinadultpatients．JClinVirol，2002，25(8)：SI～I2赵捷，闻良珍，张梓梅．人巨细胞病毒蛋白pp65诱导特异性免疫应答的研究．医学分子生物学杂志，2008，5(2)：137～140YoshihiroTsutsui，HideyaKawasaki，CytomegalovirusInfectioninMouseBrainCultures．J．Virol，20(12，76(14)：7247～7254andCellslsaoKosugi．ReactivationDetectedafterTransfertoofLatentBrainSlice郑琪．人巨绌胞病毒ULl28趋化因子功能鉴定及致耳聋机制研究：【博士学位论文】江：浙江大学，2012KristinaOresic，andDomenicoTortorella．EndoplasmicreticulumchaperonesparticipateinhumancytomegalovirusUS2一mediateddegradationofclassImajorhistocompatibilitycomplexmolecules．J．Gen，Vir01．，2008，89(5)：1l22--1130NagendraR．Hegde，RomanA．Tomazin，ToddW．Wisner．InhibitionofHLA—DRAssembly，Transport，andLoadingbyHumanCytomegalovirusGlycoproteinUS3"aNovelMechanismforEvadingMajorHistocompatibilityComplexClassIIAntigenPresentationJ．Vir01．，2002，76(21)：10929--10941AnneHalenius，SebastianHauka，LarsDolken，eta1．HumanCytomegalovirusDisruptstheMajorHistocompatibilityComplexClassIPeptide—LoadingComplexandInhibitsTapasinGeneTranscription．J．Vir01．，2011，85(7)：3473～3485SOLee，SHwang，JPark，gta1．FunctionaldissectionofHCMVUS1inmediatingthedegradationofMHCclassImolecules．BiochemBiophysResCommun，2005，330(4)：1262--1267EddieC．Y．Wang，BrianMcSharry，ChristelleRetiere，eta／．UL40一mediatedNKevasionduringproductiveinfectionwithhumancytomegalovirus．PNAS2002，99(11)：7570--7575GavinW．G．Wilkinsona，PeterTomaseca，RichardJ．Stantona，ela1．Modulationofnaturalkillercellsbyhumancytomegalovirus．JClinVirol，2008，41(3)：206--212【11]MiillerS，elucidates2010，6(1)MarkR．ZocherG，selectbindSteinleA，andStehleT．StructureoftheHCMVULl6一MICBcomplexingofaviralimmunoevasintodiverseNKG2Dligands．PLoSPathog，l～12Wills，OmodeleAshiru，MatthewB．Reeves，eta1．Humancytomegalovirus 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