人巨细胞病毒潜伏激活诊断试剂盒的研制和相关研究

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1、上海交通大学硕士学位论文人巨细胞病毒潜伏激活诊断试剂盒的研制和相关研究姓名：钱春艳申请学位级别：硕士专业：临床检验诊断学指导教师：季育华20070401上海交通大学医学院04级硕士研究生学位论文人巨细胞病毒潜伏激活诊断试剂盒的研制和相关研究摘要目的制备人巨细胞病毒pp65抗原血症检测试剂盒，并对pp65蛋白在外周血白细胞内的定位及意义进行探讨。建立检测HCMVpp65抗体的间接ELISA方法。方法以重组表达的HCMVpp65蛋白为抗原，运用杂交瘤技术制备单抗，对筛选获得的单抗进行鉴定，并以间接免疫荧光法与进口同类产品进行比较；将自制小鼠IgG免疫家

2、兔获得的二抗进行标记，获得完整的检测试剂盒，以间接免疫荧光法与进口同类产品进行比较；通过DAPI染色、间接免疫荧光法和共聚焦显微镜扫描三者结果共同确定HCMVpp65蛋白在细胞中的定位，并对部分移植患者进行动态跟踪；以重组表达蛋白HCMVpp65为抗原，建立间接ELISA法检测其特异性IgG型抗体，并对不同人群的检测结果进行分析。结果获得3株针对HCMVpp65蛋白的单抗，即B6、G12、2B12；Ig7亚型依次为IgG1κ型、IgG1κ型、IgMκ型；亲合常数依次为3.6×10L/mol、783.8×10L/mol、3.1×10L/mol。免疫印

3、迹试验结果表明3株单抗都与HCMVpp65蛋白特异性的结合，除2B12外，B6、G12与EBV、HSV1、HSV2均无交叉反应；与进口单抗平行检测140份临床标本，结果-1-上海交通大学医学院04级硕士研究生学位论文一致。与自行标记异硫氰酸荧光素的二抗配套检测HCMVpp65抗原，并以免疫荧光检测法与进口同类产品进行比较，通过与进口同类试剂盒平行检测16份临床标本，结果一致；结合DAPI染色、间接免疫荧光法和共聚焦显微镜扫描结果，发现阳性细胞有胞浆阳性、胞核阳性和核浆阳性3种表现形式，对于胞核阳性的细胞，pp65蛋白主要定位在细胞核内，非核膜部分；

4、间接ELISA法检测HCMVpp65-IgG的最佳包被抗原浓度为10ng/孔，酶标二抗的工作浓度为1:3000。当阳性判断值A为0.298时，87份不同组的血清标本（HCMV感染活动组、HCMV感染不活动组、HCMV未感染组）阳性检出率分别为51.6％、12.1％和0。三组两两间均存在显著性差异（P<0.01）。结论自制检测试剂盒能够识别HCMVpp65抗原，为HCMVpp65抗原血症国产化检测试剂盒的研制奠定了基础；初步确定HCMVpp65蛋白在外周血白细胞的内的分布，同时结合阳性细胞的数量动态跟踪检测结果可能更有意义，但是还需要更多临床样本来明

5、确；建立了检测HCMVpp65IgG抗体的间接ELISA方法，应用本方法能从相应人群中检出该抗体，无假阳性存在，并与抗HCMVIgM的检出率有关。关键词人巨细胞病毒，pp65，单克隆抗体，定位，IgG-2-上海交通大学医学院04级硕士研究生学位论文DEVELOPENTOFTHEHCMVLATENT–ACTIVEDIAGNOSISKITANDTHERELATEDSTUDYABSTRACTObjectsToprepareadiagnosiskitagainsthumancytomegalovirus–phosphorylatedprotein65(HC

6、MVpp65)antigenaemia,andclarifythelocalizationofpp65proteininPMNLsanditssignificance.Atthemeantime,weestablishedanovelELISAmethodfordetectionofanti-HCMVpp65-IgGinserum.MethodsUsingtherecombinantproteinHCMVpp65asanantigen,wescreenthehybridomacelllines,whichcouldsecretthetargetan

7、tibody.Themonoclonalantibodieswerecharacterizedafterpurification.Thesecondantibody,whichwasobtainedpreviously,waslabelledwithHRPandFITC.Whenwesetupthewholediagnosismethod,wecompareditwithotherimportedproductsbyimmunofluorescenceassay.UsingtheDAPIstaining,indirectimmunofluoresc

8、enceassayandcofocalmicroscopeassay,wewanttomakesurethepp65pro