鸡传染性贫血病毒重组抗原间接ELISA诊断试剂盒的研制

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1、中国农业科学研究院硕士学位论文鸡传染性贫血病毒重组抗原间接ELISA诊断试剂盒的研制姓名：王英申请学位级别：硕士专业：预防兽医学指导教师：王笑梅20040601鸡传染性贫血病毒重组抗原间接ELISA诊断试剂盒的研制摘要鸡传染性贫血(chickeninfectiousanemia，CIA)是由鸡传染性贫血病毒(chickeninfectiousanemiavirus．CIAV)引起雏鸡的以坏疽、淋巴组织损伤和骨髓发育不全为特征的传染病，是继IBD后的一种重要的免疫抑制性疾病。目前，本病已成为世界性疾病，严重地威胁着养禽业。但在现地，由于并发继发的病毒性、细菌性传染病或球虫病升高

2、了ClA的死亡率．而且以后者症状更为突出，导致临床对本病的忽视，并且因为传统CIA血清学方法中的血清中硐I试验(SN)和间接免疫荧光试验(IFA)存在着费时、费力、对操作者技术要求高和仅适于实验室诊断的问题，因此，急需一种快速、简便、敏感、廉价和能检测人批量样品的诊断方法川于免疫鸡群的抗体监测和流行病学调查。CIAV的VPI蛋白不仅是病瑶的唯一农壳蛋自，也是主要的免疫原蛋白。本试验J_

3、{j生物软件分析vpl基凶及其编码产物，预测了该蛋白的抗原表位，并对预测的其富含抗原表位的c末端基冈进行了原核表达。根据GenBank公布的标准毒株Cux-1基因序列，设计合成了一对引物，对C

4、IAV-M9905株的vpl基因进行PCR扩增，产物经琼脂糖凝胶电泳分析．可见一条1350bp的特异带，J}jPstl酶切后，将其回收，克隆到pProEXHTa载体，再亚克隆到pGEX．6p．1载体中，得到重组质粒pGEX—vpl，PCR鉴定为阳性者再用BamHl消化刚性质粒，琼脂糖凝胶试剂盒回收大片段，臼连后转化感受态细胞，HjBamHl鉴定为目J性者命名为pGEX．vpl(c)．得到口的克隆。将重组阳性质粒pGEX．vpl(c)转入表达宿主菌BL2l中，经终浓度为0．6mmol／LIPTG诱导，成功表达了VPIC端基因．重组蛋白表达量占苗体蛋白的39．4％。经ELISA检

5、测表明，表达的重组蛋白能被CIAV冈1性血清识别，具有良好的抗原性。把表达的重组蛋白经初步纯化后J=}=

6、作包被抗原，建立了检测CIAV血清抗体的间接ELISA方法，井确定了最适封闭液、虽适抗原包被浓度、最适血清稀释应、血清最适作用时间、酶标抗体晟适稀释度和最适作_LIJ时间及底物虽适显色时间。包被的重组抗原不与鸡新城疫(ND)、马立克氏病(MD)、传染性支气管炎(IB)-I型和1I型、禽流感(A0一H9和H7型、鸡法氏囊病(IBD)、鸡网状内皮组织增生病(RE)、禽白血病(AL)-J亚群、鸡白痢阳性血清发生交叉反应，表明建立的ELISA诊断方法只有良好的特异性。用该方法可检

7、山人工攻毒后110天81％的CIAV血清抗体，表明其具有很高的敏感性。批内重复试验，变异系数小于10％：批问重复试验。变异系数小于15％．说明具有很好的重复性。与全病毒抗原检测结果符合率为92％以上，与进口试剂盒的符合率达97％。本研究在国内首次成功表达了CIAVVPI蛋白抗原表位优势区．并成功建立了ELISA诊断方法。CIAV重组抗原间接ELISA诊断试剂盒的研制，为免疫鸡群抗体监测和进行CIA流行病学调查提供了一种快速简便的血清学方法。关键词：鸡传染性贫血病毒，VPl基因，重组抗原，间接ELISADevelopmentofanindirectELISAKittodetec

8、tanti-CIAVserawithrecombinantantigenABSTRCTChickeninfectiousanemia(CIA)iscausedbychickeninfectiousanemiavirus(CLAY)Itcharac—terizedbynecrosisandlymphoiddepletioninlymphatictissues．aswellasaplasiaofthebonemarrowinyoungchickens．CIAisanimportantandimmunosuppressiVediseasetreateningpoultryindus

9、tryandhasbeenacosmopolitandisease．However'inthefield，thediseaseisusuallyconcurrentwithothervirosis，bacteroidaldiseaseandcoccidiosis，andaggravatethemortalityofCIA，furthermorethelattersignismoreoutstanding．ThatistheonereasonthatCIAisneglectedinprevention．M