猪圆环病毒2型抗体间接ELISA检测试剂盒的研制和应用

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1、中国农业大学硕士学位论文猪圆环病毒2型抗体间接ELISA检测试剂盒的研制和应用姓名：李宁申请学位级别：硕士专业：预防兽医学指导教师：杨汉春;郭鑫20040601中文摘要利用已构建的基因工程重组菌BL21(DE3)表达猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2编码的结构蛋白．并成功摸索出一种快速纯化该蛋白的方法。用纯化的蛋白作为包被抗原，建立了检测猪血清中PCV2抗体的问接ELISA方法；以该方法为基础初步组装出试荆盒，并进行了初步应蹦。对ELISA的反应条件进行了探索，确定了最适工作条件。结果表明，重组蛋白抗原的昂适包被浓度为O．199／mL，最适包被条件为37"C2h加4"C过夜；待检血清的

2、稀释度为1：40；HRP．兔抗猪IgG的工作浓度为1：800；待检血清和酶标二抗的反应条件和反应时间均为37"C30min：底物室温显色10-15min：阴阳性临界值为0．4。经阻断试验、交叉反应试验和重复性试验，表明建立的间接ELISA方法是特异的，且重复性很好；与间接免疫荧光试验(IFA)进行比较，其敏感性和特异性分别是94．3％和90％，说明两种检测方法间无显著性差异：进行了试剂盒的组装及其保存期试验，结果表明试剂盒在4℃下至少可保存三个月。用试剂盒检测人工感染PCV2组织毒的SPF小香猪血清，并绘制血清中抗体变化的动态曲线。结果显示，攻毒后14,--2l天血清抗体出现阳转化，抗

3、体水平的高峰期出现在感染后28---35天，其后，抗体水平开始下降。用试剂盒对我国13个地区70个规模化养猪场的2007份猪血清进行了PCV2感染的普查，结果表明自1997年以来PCV2感染已在我国普遍存在。关键词：PCV2：重组蛋白：ELISA；试剂盒；应用AbstractInthisstudy，thestructuralproteinencodedbyORF2ofPCV2wasexpressedinrecombinantE．coliBL21(DE3)andavalidmethodofpuri5，ingthePCV2-ORF2recombinantfusionproteinwasde

4、veloped．Usingthepurifiedrecombinantproteinascoatingantigen，anindirectELlSAwasestablishedfordetectionofantibodyinsernmtoPCV2．ELISAkitwasprimarilypreparedandappliedfordetectionofantibodiesinserunlsamplesfrompigletsinfectedexperimentallyandswinefarms．Thevario／isfactorsandconditionsforELISAwereexplo

5、red．andtheoptimalreactionconditionsweredetermined．ItwasshownthattheoptimalconcentrationofPCV2-ORF2mcombinantproteinforcoatingofplatewas0．1gg／mL，theoptirealcoatingconditionofmcombinantproteinwas3TCfor2hoursand4"Covemight，thedilutionofserumsamplewasl：40．theworkingconcentrationofHRP-labeledrabbitan

6、ti-proteinIgGwas1：800，sevtllnsampleforde'reefingandHRP-labeledrabbitanti·porcineIgGshouldbemcubatedat37"Cfor30minbeforeterminatedwiththestoppingsolution．ThethresholdforELISAwas0．4．TheblockingtestforthereactionbetweenthepositiveserulnofPCV2andtherecombinantproteinwascarriedoutbyusingPCV2harvested

7、incellculture．TheresultsindicatedthatPCV2couldblockthereactioncompletely．Itwasalsoconfirmedthattherewasnocrossreactionbythecrossingtest．Meanwhile，theELISAhadidealrepeatabilitywhileitwasdonebothinthesamedayandthedifferentdays