鸡传染性法氏囊病间接ELISA抗体检测试剂盒的研究

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1、中文摘要本研究将IBDV(CJ801)囊毒在鸡胚上盲传4代而后在鸡胚成纤维细胞上连传7代得到了CEF适应毒。大量繁殖细胞毒。经o．1％甲醛灭活，经蔗糖梯度密度离心法将其纯化。用纯化的IBDV作为包被抗原，建立了一种检测血清中IBDV抗体的问接ELlsA方法。通过对ELISA反应条件的系列摸索，确定了各组分的最适工作条件，并初步组装成试剂盒。试验结果表明，Costar公司生产的酶标板的变异系数为3．7％，达到ELISA的要求：IBD抗原最适包被浓度为o．0128微克，微升，最适包被条件为4"C过夜，血清稀释度为1

2、：200，HRP一兔抗鸡碴G的最适工作浓度为l：800，待拉血清和酶标二抗的反应对闯均为37℃J小时，底物在室温显色20分钟。根据已经建立的ELISA方法及反应条件，确定阴阳性临界值为0．17。用本试剂盒检测己知的IBDV的BJ836、cJ901、2512、Cu和Harbin株单因子血清呈阳性反应。而与已知的SPF鸡血清呈阴性反应。用本试剂盒检测IBV，EDS’76，NDlasota,!t9亚型AIV等单因子血清无交叉反应，说明建立的ELISA具有很好的特异性。本试剂盒与西班牙HIPRA公司IBDV抗体检测试剂

3、盒的比较结果表明；两者共同检测60份血清，阴阳符台率达到96％{平行检添44份血清样品，两者检测结果呈线性关系．且相关系数为0．900。对包被好的反应板、酶标二抗、阴阳性血清和试剂盒的保存条件进行摸索，由于时间关系，只傲到3个月。通过引入质控血清进行试剂盒的批内、批间重复性测试的方法，达到了试剂盒质量控制的目的。本研究建立了一种快速、准确的检测方法。为我国IBD的免疫监测和血清学调查提供了行之有效的技术手段。关键词：鸡传染性法氏囊病间接ELISA试剂盒AbstractCJ801strainofIBDVwascu

4、lturedcontinuouslyforfourtimesinchickenembryo，andthenculturedforseventimesinCEF．WeobtainedadaptedvirusofCEF．Thenlotsoftheseinactivitiedviruswaspurifiedwithmethodsofsucrosegradientdensitycentrifugation．UsingtheinactivatedCJS01strainofIBDV8scoatingantigen，alli

5、ndirectELISAwassuccessfullydevelopedfordetectinganti-IBDVantibodyinserumandELISAtestkitwasprimarilyprepared．Conditionswereoptimizedforusingthesepreparationsforall1BDV-specificELISA．TheresultwasshownthatELISAplatesfromCostarwassuitableforELISAkit,theoptimalco

6、ncentrationofIBDVforcoatingofplatewasO．0128ug／uI．theoptimalcoatingconditionof1BDVforELISAwas4"Covernight，thedilutionofserumsamplewas1：200，theworkingconcentrationofHRP-labeledrabbitanti-chickenIgGwast：800，selqllnsamplefordetectingandHRP-labeledrabbitanti-chic

7、kenIgGshouldbeincubatedat37℃forlhrespectively,thesubstrateforELISAwasincubatedatRTfor20minbeforereadingtheOD655．FollowingthedeterminationofconditionsofELISA，thethresholdvalueofELISAwas0．17．SerumsamplesagainstBJ836、CJ801、2512、CuandHarbinweredetectedfortheanti

8、bodytoIBDVbyusingthedevelopedELISA．ItwaSfoundthattherewerecross-reactionbetweentheantibodiesandCJ801strainoflBDV．Meanwhile．itwasconfirmedthattherewerenocross-reactionbetweentheantibodiesagainstN