gbt 17494-2009 马传染性贫血病间接elisa诊断技术

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1、lCS11．220B41a亘中华人民共和国国家标准GB／T17494--2009代替GB／T17494--1998马传染性贫血病间接ELISA诊断技术DiagnostictechniquesofindirectELISAtechniqueforequineinfectiousanemiadisease2009-04-23发布2009—09—01实施宰瞀鹊紫瓣訾矬瞥星发布中国国家标准化管理委员会仪1”刖罱GB／T17494--2009本标准参照世界动物卫生组织(OIE)最新公布的《陆生动物诊断试验和疫苗手册》2004年版，并结合我国现有动物卫生法规及

2、农业部对马传贫的相关政策和措施修订，其技术内容与OIE所推荐的基本一致。本标准代替GB／T17494--1998(马传染性贫血病间接ELISA技术规程》。本标准与GB／T17494—1998相比主要变化如下：——“前言”部分作适当变动；——删除第2章的内容；——第4章“仪器设备”和第5章“试剂”部分改为“材料准备”，并对内容作较大的改动；——第6章“配制溶液”部分放置在附录内；——修订原标准中的所有语句和计量单位等错误用法。本标准的附录A、附录B、附录C和附录D为规范性附录。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国动物防疫标准化技术委员会(S

3、AC／TC181)归口。本标准由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所负责起草。本标准主要起草人：相文华、郭巍、赵立平、戴玉坤。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：——GB／T17494--1998。马传染性贫血病间接ELISA诊断技术GB／T17494--20091范围本标准规定了马传染性贫血病间接ELISA诊断技术的测定原理、材料准备、操作方法和结果判定等。本标准适用于检测马血清中的马传贫病毒抗体。可用于生产和经营马匹者对未注射马传贫疫苗马匹的检疫、马传贫病马的定性，也可用于对注射马传贫疫苗马匹的免疫状态进行测定。2测定原理用制备的马传贫病毒抗原，包

4、被聚苯乙烯微量板孔，使免疫反应在固相载体上进行。当被检血清中有马传贫病毒抗体存在时，则与孔壁上的抗原形成抗原一抗体复合物，再与酶标记的抗体(抗马免疫球蛋白)反应，最后通过测定酶作用底物催化后的产物，进行马传贫病毒抗体的定性、定量测定。3材料准备3．1器材3．1．196孔平底微量反应板。3．1．2微量移液器。3．1．3酶标测定仪。3．1．4恒温箱。3．1．5保湿盒等。3．2试剂3．2．1兔抗马IgG辣根过氧化物酶结合物(简称酶标抗体)为冻干品，见附录A。3．2．2马传贫病毒抗原包被板见附录B。3．2．3马传贫病毒标准阳性血清和标准阴性血清均为冻干品。

5、3．2．4磷酸盐缓冲液(O．02mol／L，pH7．2，PBS)配制方法见第C．1章。3．2．5洗涤缓冲液(o．02mol／L，pH7．2，PBS-0．05％吐温一20)的配制方法见第C．2章。3．2．6血清及酶标记抗体稀释液(o．02mol／L，pH7．2，PBS-0．05％吐温一20—0．1％白明胶一10％健康牛血清)的配制方法见第C．3章。3．2．7底物缓冲液(pH5．0磷酸盐一柠檬酸缓冲液，内含0．04％邻苯二胺及0．045％过氧化氢)的配制方法见第c．4章。3．2．8终止液(2mol／L，硫酸)的配制方法见第C．5章。4操作方法4．1冲洗

6、包被板：向各孔注入洗涤缓冲液，浸泡3min，甩干，再注入洗涤缓冲液，重复3次。甩干孔内残液，在滤纸上吸干。4．2加被检血清及对照血清：将每份被检血清样品各取50pL加入到血清稀释板的各孔内，再将稀释液0．95mL依次加入各孔内，作1：20倍稀释。混匀后分别取100pL依次加入抗原包被反应孔中，每份血清加两个孔。每块反应板设阴性血清和阳性血清对照各两孔，每孔100pL。盖好包被板置37℃湿盒内1h，冲洗同4．1。4．3加酶标记抗体：用酶标抗体稀释液将冻干酶标记抗体稀释至工作浓度，每孔加100pL，置37℃湿1GB／T17494--2009盒内1h，冲

7、洗同4．1。4．4加底物缓冲液：每孔加新配制的底物溶液100pL，在室温下避光反应5min～10min,见附录D。4．5终止反应：每孔加终止液20pL～30“L。5结果判定5．1目测法阳性对照血清孔呈鲜明的桔黄色，阴性对照血清孔无色或基本无色，被检血清孔凡显色者即判为马传贫病毒抗体阳性。如遇颜色反应较弱，但与阴性对照血清孔还有差异者，用目测法难以判定时，则以比色法测定为最终结果。5．2比色法用酶标测试仪，在波长492Ylm下，测定各孔OD值，阳性对照血清两孔平均OD值大于1．0，阴性对照血清两孔平均OD值小于等于0．2为正常反应。按以下标准判定结果

8、：被检血清的两孔平均OD值与阴性对照血清的两孔平均OD值之比，大于或等于2，且被检血清的两孔平均019值在0．2以上者，判