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《行业标准:GBT 17494-2009 马传染性贫血病间接ELISA诊断技术.pdf》由会员上传分享,免费在线阅读,更多相关内容在行业资料-天天文库。
1、lCS11.220B41a亘中华人民共和国国家标准GB/T17494--2009代替GB/T17494--1998马传染性贫血病间接ELISA诊断技术DiagnostictechniquesofindirectELISAtechniqueforequineinfectiousanemiadisease2009-04-23发布2009—09—01实施宰瞀鹊紫瓣訾矬瞥星发布中国国家标准化管理委员会仪1”GB/T17494--2009刖罱本标准参照世界动物卫生组织(OIE)最新公布的《陆生动物诊断试验和疫苗手册》2004年版,并结合我国现有动物卫生法规及农业部对马传贫的相关政
2、策和措施修订,其技术内容与OIE所推荐的基本一致。本标准代替GB/T17494--1998(马传染性贫血病间接ELISA技术规程》。本标准与GB/T17494—1998相比主要变化如下:——“前言”部分作适当变动;——删除第2章的内容;——第4章“仪器设备”和第5章“试剂”部分改为“材料准备”,并对内容作较大的改动;——第6章“配制溶液”部分放置在附录内;——修订原标准中的所有语句和计量单位等错误用法。本标准的附录A、附录B、附录C和附录D为规范性附录。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国动物防疫标准化技术委员会(SAC/TC181)归口。本标准由中国农业科学
3、院哈尔滨兽医研究所负责起草。本标准主要起草人:相文华、郭巍、赵立平、戴玉坤。本标准所代替标准的历次版本发布情况为:——GB/T17494--1998。GB/T17494--2009马传染性贫血病间接ELISA诊断技术1范围本标准规定了马传染性贫血病间接ELISA诊断技术的测定原理、材料准备、操作方法和结果判定等。本标准适用于检测马血清中的马传贫病毒抗体。可用于生产和经营马匹者对未注射马传贫疫苗马匹的检疫、马传贫病马的定性,也可用于对注射马传贫疫苗马匹的免疫状态进行测定。2测定原理用制备的马传贫病毒抗原,包被聚苯乙烯微量板孔,使免疫反应在固相载体上进行。当被检血清中有马传
4、贫病毒抗体存在时,则与孔壁上的抗原形成抗原一抗体复合物,再与酶标记的抗体(抗马免疫球蛋白)反应,最后通过测定酶作用底物催化后的产物,进行马传贫病毒抗体的定性、定量测定。3材料准备3.1器材3.1.196孔平底微量反应板。3.1.2微量移液器。3.1.3酶标测定仪。3.1.4恒温箱。3.1.5保湿盒等。3.2试剂3.2.1兔抗马IgG辣根过氧化物酶结合物(简称酶标抗体)为冻干品,见附录A。3.2.2马传贫病毒抗原包被板见附录B。3.2.3马传贫病毒标准阳性血清和标准阴性血清均为冻干品。3.2.4磷酸盐缓冲液(O.02mol/L,pH7.2,PBS)配制方法见第C.1章。3
5、.2.5洗涤缓冲液(o.02mol/L,pH7.2,PBS-0.05%吐温一20)的配制方法见第C.2章。3.2.6血清及酶标记抗体稀释液(o.02mol/L,pH7.2,PBS-0.05%吐温一20—0.1%白明胶一10%健康牛血清)的配制方法见第C.3章。3.2.7底物缓冲液(pH5.0磷酸盐一柠檬酸缓冲液,内含0.04%邻苯二胺及0.045%过氧化氢)的配制方法见第c.4章。3.2.8终止液(2mol/L,硫酸)的配制方法见第C.5章。4操作方法4.1冲洗包被板:向各孔注入洗涤缓冲液,浸泡3min,甩干,再注入洗涤缓冲液,重复3次。甩干孔内残液,在滤纸上吸干。4.
6、2加被检血清及对照血清:将每份被检血清样品各取50pL加入到血清稀释板的各孔内,再将稀释液0.95mL依次加入各孔内,作1:20倍稀释。混匀后分别取100pL依次加入抗原包被反应孔中,每份血清加两个孔。每块反应板设阴性血清和阳性血清对照各两孔,每孔100pL。盖好包被板置37℃湿盒内1h,冲洗同4.1。4.3加酶标记抗体:用酶标抗体稀释液将冻干酶标记抗体稀释至工作浓度,每孔加100pL,置37℃湿1GB/T17494--2009盒内1h,冲洗同4.1。4.4加底物缓冲液:每孔加新配制的底物溶液100pL,在室温下避光反应5min~10min,见附录D。4.5终止反应:每
7、孔加终止液20pL~30“L。5结果判定5.1目测法阳性对照血清孔呈鲜明的桔黄色,阴性对照血清孔无色或基本无色,被检血清孔凡显色者即判为马传贫病毒抗体阳性。如遇颜色反应较弱,但与阴性对照血清孔还有差异者,用目测法难以判定时,则以比色法测定为最终结果。5.2比色法用酶标测试仪,在波长492Ylm下,测定各孔OD值,阳性对照血清两孔平均OD值大于1.0,阴性对照血清两孔平均OD值小于等于0.2为正常反应。按以下标准判定结果:被检血清的两孔平均OD值与阴性对照血清的两孔平均OD值之比,大于或等于2,且被检血清的两孔平均019值在0.2以上者,判
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