抗狂犬病病毒单克隆抗体的制备及初步研究

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1、PreparationandPrimaryApplicationsofanti．．rabiesvirusmonoclonal』●11●antl1)0diesThesissubmittedtolaeSlSSUl9daoAgriculturalUniversityInFulfillmentoftheRequirementfortheDegreeofMasterofAgronomyWangWen-juan(CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine)Supervisor：ProfiShanHuProfiTangQin

2、gQingdao，ChinaJune，2012独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得青岛农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：时间：≯7工年6月以日关于论文使用授权的说明本人完全了解青岛农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或

3、扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意青岛农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。I保密的学位论文在解密后应遵守此协议)研究生签名：；京蹭时间：如I工年g月土7日导师签名：时间：加f2，年6月三

4、7青岛农业火：学：硕士生毕业论文摘要抗狂犬病病毒单克隆抗体的制备及初步应用摘要狂犬病是一种重要的世界性人兽共患传染病，据卫生组织报告，全球每年报告5．5万例人狂犬病，该病病程进展迅速，一旦发病，100％死亡，而且全世界该病治愈病例极少，因此对该病的准确快速、特异性的诊断方法和有效的疫苗的研究显得尤为重要。1978年Wiktor报道狂

5、犬病病毒单克隆抗体的制备，此后，狂犬病病毒单克隆抗体在狂犬病的诊断和免疫学分析中得到了广泛的应用，并有望在狂犬病暴露后预防中替代免疫球蛋白发挥作用。WHO推荐的用于狂犬病病原学实验室诊断的金标准免疫荧光(DFA)vX59．'i5x价狂犬病病毒(RV)中和抗体的快速免疫荧光灶抑制试验(RFFIT)已经广泛应用于国内外。这两种检测方法均需要抗RV核蛋白fNe)荧光标记抗体，而RV在细胞培养中的产量较低，不易从RV颗粒获得大量纯化的NP，目前这种检测试剂在国内尚没有获得批准文号和商业途径可以获得，而进口产品价格昂贵，因此限制了这两种检测方法在国内的普遍应用和标

6、准化。鉴于这种情况，此类研究的开展，将非常有助于发展我国具有自主知识产权的狂犬病实验室检测和诊断用试剂，提高我国狂犬病监测能力。本实验分为三部分内容，包括狂犬病病毒单克隆抗体的制备鉴定，单克隆抗体的标记以及标记单抗的初步应用。本实验室采用人用狂犬病疫苗PV株、杆状病毒表达的RV核蛋白以及狂犬病病毒野毒株HNl0，作抗原免疫6．8周龄雌性BALB／c小鼠，取其脾细胞与SP2／0骨髓瘤细胞按常规方法进行融合；利用间接免疫荧光法筛选杂交瘤细胞后，经克隆后建株，获得特异稳定分泌抗狂犬病病毒单克隆抗体细胞株，并将此细胞株经小鼠腹腔注射制备单抗腹水；然后进行了抗体亚

7、类、特异性和敏感性以及蛋白免疫印记等的系统鉴定，利用SPA亲和层析的方法进行腹水纯化，通过常规方法对所得单抗进行辣根过氧化物酶(HRP)和异硫氰酸荧光素(FITC)标记，确定FITC标记抗体的工作浓度后对实验室现存的部分标本进行了检测，设置Millipore公司的标记单抗为阳性对照，对两者的检测结果进行了分析比较。每次融合，融合率达到80％v1‘上，融合后，立即将融合细胞液稀释到15．20块融合板，经过陆续三批的检测，1-2次的亚克隆，最终获得3株(3812、4A12和588)特异稳定分泌抗狂犬病病毒单抗细胞株，前两者腹水效价分别为1：8000，1：10

8、000。青岛农业大学硕士生毕业论文摘要由于588获得比较晚，后续工作针对前两株单抗进行，经鉴定，单抗亚类型为抗狂犬病病毒IgG2a亚类；经Western．blot鉴定两株单抗细胞株能高效价稳定特异分泌抗狂犬病病毒核蛋白单抗，且具有良好的稳定性和特异性；所得的FITC标记单克隆抗体3812和HRP标记的4A12的工作浓度为1：80和1：800。用所得的荧光标记的单克隆抗体细胞3812株(FITC．3812)通过直接免疫荧光法，检测本实验室保存的标本34份，其中阳性标本24份，阴性10份，阳性率为100％。结果证明3812株标记单抗建立的直接免疫荧光法对广泛

9、存在的狂犬病病毒街毒株的检出具有较好的特异性和准确性。关键词：狂犬病病毒；单克隆