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时间:2020-05-14
《高迁移率族蛋白1促进小鼠心肌成纤维细胞增殖和迁移.pdf》由会员上传分享,免费在线阅读,更多相关内容在行业资料-天天文库。
1、细胞与分子免疫学杂志(ChinJCellMolImmuno1)2015,31(5657·论著·文章编号:1007—8738(2015)05"065703高迁移率族蛋白1促进小鼠心肌成纤维细胞增殖和迁移张盼,倪萍,苏晓莲,应欣宇,汪汀,杨慧建,徐芸芸,许化溪,苏兆亮(江苏大学免疫学研究所,江苏镇江212013)[摘要]目的探讨高迁移率族蛋白1(HMGB1)对心肌成纤维细胞的增殖和迁移以及对胞内基质金属蛋白酶一1(MMP-1)、MMP-2、金属蛋白酶组织抑制物1(TIMP1)表达的影响。方法HMGB1作用于分离培养的1~2周新生小鼠心肌成纤维细胞,24h后,采用MTr法检测细胞增殖。心肌成
2、纤维细胞在HMGB1作用6、24、48h后,反转录PCR检测MMP·1、MMP-2、TIMPI的mRNA水平、Westernblot法检测MMP.1、MMP-2和TIMP1的蛋白水平。另外,lsweU实验检测HMGB1对心肌成纤维细胞迁移的影响。结果与对照组相比,HMGB1作用于心肌成纤维细胞24h后,细胞增殖明显增加。心肌成纤维细胞在HMGB1作用后,MMP.1、MMP-2、TIMP1的mRNA和蛋白水平均明显升高。与对照组相比,TranswelTM实验结果显示HMGB1促进心肌成纤维细胞迁移。结论HMGB1可以促进心肌成纤维细胞的增殖和迁移,上调MMP-1、MMP-2、TIMP1的
3、表达。[关键词]高迁移率族蛋白B1;心肌成纤维细胞;金属基质蛋白酶[中图分类号]R392-33,Q256,Q291[文献标志码]A实验性自身免疫性心肌炎(experimentalauto—小鼠抗MMP.1单克隆抗体(monoclonalantibody,mAb)、小鼠抗MMP-2抗体、小鼠抗金属蛋白酶组织抑制物1(tissueimmunemyocarditis,EAM)是一种良好的CD4T细inhibitorofmetalloproteinase1,TIMP1)mAb、小鼠抗6一actin胞介导的感染后自身免疫性心肌炎模型,心脏中常mAb购自Abcam公司,辣根过氧化物酶标记的兔抗小鼠
4、IgG伴随大量炎细胞浸润,心肌细胞坏死,心肌成纤维细购自CellSignalingTechnology公司。胞、肌纤维母细胞胶原沉积、心肌的纤维化¨。前期1.2方法研究发现EAM时血清高迁移率族蛋白1(high1.2.1细胞分离培养无菌条件分离1~2周龄BALB/c小mobilitygroupbox1,HMGB1)与Thl7细胞的浸润以鼠心脏,剪成小块,1g/L胰蛋白酶和2g/LII型胶原酶联合及后期心肌胶原的表达密切相关。心肌的纤维化消化1h,至组织块消失,350g离心收集细胞,含100mL/L除与胶原的表达有关外,还与心肌成纤维细胞的增灭活胎牛血清的DMEM培养,培养基中加入100
5、U/mL青霉殖、迁移以及基质金属蛋白酶(matrix素和100ms/L链霉素,置于37℃、50mL/LCO2箱中。2hmetaloproteinases,MMP)的表达密切相关。因此,本后弃去悬浮的未贴壁细胞,更换培养液。每天观察细胞的形研究旨在探讨HMGB1对心肌成纤维细胞的增殖、迁态、数目、贴壁情况、培养液颜色及透明度,2~3d更换1次移以及MMP表达的影响,为寻找自身免疫性心肌炎培养液。待细胞长满平皿后,用含2.5g/L胰蛋白酶消化传干预和治疗的新途径和展现HMGB1临床开发应用代。3—5代心肌成纤维细胞用于实验。前景等方面提供有意义的参考。1.2.2总RNA的提取及实时定量PC
6、R检测分离培养至3~5代的小鼠心肌成纤维细胞,根据预实验结果选择1材料和方法50ng/mL~b源性HMGB1刺激0、6、24、48h,用TRIzol一步1.1材料法提取总RNA,逆转录获得cDNA模板,然后用MMP-1、1—2周龄BALB/c小鼠购自扬州大学动物中心,饲养于MMP-2、金属蛋白酶组织抑制物1(dssueinhibitorof江苏大学动物中心。DMEM高糖培养基、胎牛血清购自Gibcometalloproteinase1,佃1)编码区特异性引物(MMP-1的上游引物公司,TRIzol试剂购自Invitrogen公司,Q—PCR试剂盒、PCR为5.TGAATGGC从GGAG
7、ATG-3,下游引物为5-AACGAG-试剂盒购自TaKaRa公司,Transwell小室购自Costar公司,GATYGTrGTGAGTA-3;MMP-2的上游引物为5一CCCCGAT-引物由上海生工公司合成,实时荧光定量PCR扩增仪购白GCTGATACTGA-3。下游引物为5'-TGTCCGCCAAATAAACC-3;ABI公司。自动酶联免疫分析仪购自Bio-Rad公司。TIMP1的上游引物为5,_CAGAACCGCAGTGAAGAG·3,
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