高迁移率族蛋白1促进小鼠心肌成纤维细胞增殖和迁移.pdf

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1、细胞与分子免疫学杂志(ChinJCellMolImmuno1)2015，31(5657·论著·文章编号：1007—8738(2015)05"065703高迁移率族蛋白1促进小鼠心肌成纤维细胞增殖和迁移张盼，倪萍，苏晓莲，应欣宇，汪汀，杨慧建，徐芸芸，许化溪，苏兆亮(江苏大学免疫学研究所，江苏镇江212013)[摘要]目的探讨高迁移率族蛋白1(HMGB1)对心肌成纤维细胞的增殖和迁移以及对胞内基质金属蛋白酶一1(MMP-1)、MMP-2、金属蛋白酶组织抑制物1(TIMP1)表达的影响。方法HMGB1作用于分离培养的1～2周新生小鼠心肌成纤维细胞，24h后，采用MTr法检测细胞增殖。心肌成

2、纤维细胞在HMGB1作用6、24、48h后，反转录PCR检测MMP·1、MMP-2、TIMPI的mRNA水平、Westernblot法检测MMP．1、MMP-2和TIMP1的蛋白水平。另外，lsweU实验检测HMGB1对心肌成纤维细胞迁移的影响。结果与对照组相比，HMGB1作用于心肌成纤维细胞24h后，细胞增殖明显增加。心肌成纤维细胞在HMGB1作用后，MMP．1、MMP-2、TIMP1的mRNA和蛋白水平均明显升高。与对照组相比，TranswelTM实验结果显示HMGB1促进心肌成纤维细胞迁移。结论HMGB1可以促进心肌成纤维细胞的增殖和迁移，上调MMP-1、MMP-2、TIMP1的

3、表达。[关键词]高迁移率族蛋白B1；心肌成纤维细胞；金属基质蛋白酶[中图分类号]R392-33，Q256，Q291[文献标志码]A实验性自身免疫性心肌炎(experimentalauto—小鼠抗MMP．1单克隆抗体(monoclonalantibody，mAb)、小鼠抗MMP-2抗体、小鼠抗金属蛋白酶组织抑制物1(tissueimmunemyocarditis，EAM)是一种良好的CD4T细inhibitorofmetalloproteinase1，TIMP1)mAb、小鼠抗6一actin胞介导的感染后自身免疫性心肌炎模型，心脏中常mAb购自Abcam公司，辣根过氧化物酶标记的兔抗小鼠

4、IgG伴随大量炎细胞浸润，心肌细胞坏死，心肌成纤维细购自CellSignalingTechnology公司。胞、肌纤维母细胞胶原沉积、心肌的纤维化¨。前期1．2方法研究发现EAM时血清高迁移率族蛋白1(high1．2．1细胞分离培养无菌条件分离1～2周龄BALB／c小mobilitygroupbox1，HMGB1)与Thl7细胞的浸润以鼠心脏，剪成小块，1g／L胰蛋白酶和2g／LII型胶原酶联合及后期心肌胶原的表达密切相关。心肌的纤维化消化1h，至组织块消失，350g离心收集细胞，含100mL／L除与胶原的表达有关外，还与心肌成纤维细胞的增灭活胎牛血清的DMEM培养，培养基中加入100

5、U／mL青霉殖、迁移以及基质金属蛋白酶(matrix素和100ms／L链霉素，置于37℃、50mL／LCO2箱中。2hmetaloproteinases，MMP)的表达密切相关。因此，本后弃去悬浮的未贴壁细胞，更换培养液。每天观察细胞的形研究旨在探讨HMGB1对心肌成纤维细胞的增殖、迁态、数目、贴壁情况、培养液颜色及透明度，2～3d更换1次移以及MMP表达的影响，为寻找自身免疫性心肌炎培养液。待细胞长满平皿后，用含2．5g／L胰蛋白酶消化传干预和治疗的新途径和展现HMGB1临床开发应用代。3—5代心肌成纤维细胞用于实验。前景等方面提供有意义的参考。1．2．2总RNA的提取及实时定量PC

6、R检测分离培养至3～5代的小鼠心肌成纤维细胞，根据预实验结果选择1材料和方法50ng／mL~b源性HMGB1刺激0、6、24、48h，用TRIzol一步1．1材料法提取总RNA，逆转录获得cDNA模板，然后用MMP-1、1—2周龄BALB／c小鼠购自扬州大学动物中心，饲养于MMP-2、金属蛋白酶组织抑制物1(dssueinhibitorof江苏大学动物中心。DMEM高糖培养基、胎牛血清购自Gibcometalloproteinase1，佃1)编码区特异性引物(MMP-1的上游引物公司，TRIzol试剂购自Invitrogen公司，Q—PCR试剂盒、PCR为5．TGAATGGC从GGAG

7、ATG-3，下游引物为5-AACGAG-试剂盒购自TaKaRa公司，Transwell小室购自Costar公司，GATYGTrGTGAGTA-3；MMP-2的上游引物为5一CCCCGAT-引物由上海生工公司合成，实时荧光定量PCR扩增仪购白GCTGATACTGA-3。下游引物为5'-TGTCCGCCAAATAAACC-3；ABI公司。自动酶联免疫分析仪购自Bio-Rad公司。TIMP1的上游引物为5，_CAGAACCGCAGTGAAGAG·3，