小鼠高迁移率族蛋白1cdna克隆、原核表达与鉴定

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1、小鼠高迁移率族蛋白1cDNA克隆、原核表达与鉴定作者：石燕戴晓丽薛渊何志强周成林王胜军苏兆亮陈建国夏圣邵启祥黄新祥许化溪【摘要】目的：克隆并原核表达小鼠高迁移率族蛋白1（highmobilitygroupbox1,HMGB1）。方法：从小鼠脾脏细胞中提取总RNA，应用RTPCR获得小鼠HMGB1cDNA,经PCR扩增小鼠HMGB1基因；通过TA克隆将该基因构建到PMD18T载体中，测序鉴定；将该基因插入pET28a(+)表达载体，IPTG诱导后，可表达相对分子质量约30kDa的蛋白。蛋白质印迹鉴定表达的目的蛋白。结果：经RTPCR扩增得到648bp的DNA片段，序列分析显示与基

2、因库中报道的已知序列完全一致；构建了含有HMGB1编码序列的原核表达载体，经诱导表达、蛋白质印迹鉴定，获得相对分子质量约30kDa的融合蛋白。结论：成功克隆和表达了小鼠HMGB1基因，为HMGB1蛋白的功能试验奠定了基础。【关键词】高迁移率族蛋白；克隆；原核表达［Abstract］Objective:Tocloneandexpressmousehighmobilitygroupboxchromosomalprotein1(HMGB1)gene.Methods：8TotalRNAwasextractedfrommousespleencells,andthewholelengthofHMGB

3、1genewasobtainedbyRTPCR.TheHMGB1genewasclonedintoPMD18TvectorbyTAcloneandsequenced.ThenthegenewasinsertedintopET28a(+)expressionvector.identifiedbyWesternBlot.Results：ThetargetDNAsequenceofHMGB1wasobtainedbyRTPCRwhichwasabout648bplength，sequencingresultsshowedthatHMGB1genewasexactlyconsisten

4、twiththesequencereportedinGenBank;WesternBlotidentifiedtherewasaproteinstrapaboutMr.30000.TheHMGB1proteinwassuccessfullyexpressed.Conclusion：CloneandexpressmouseHMGB1gene.ItmightprovideafoundationforfurtherstudyontheproteinofHMGB1function.［Keywords］highmobilitygroupbox1;clone;prokaryoticexpress高迁

5、移率族蛋白1(highmobilitygroupbox1,HMGB1)是高迁移率族蛋白超家族的成员之一，是一种含量丰富的非组蛋白核蛋白［1］。编码区由6488bp组成，编码215个氨基酸，在核内具有调节基因转录和表达等作用；在细胞外HMGB1可以诱导某些炎症因子的释放，作为一种晚期炎症因子参与脓毒血症的发病过程［2,3］。最近研究表明，HMGB1也参与自身免疫性疾病的发病过程，如类风湿性关节炎，系统性红斑狼疮等［4,5］。但其确切的作用机制尚未完全清楚。本研究克隆并表达了小鼠HMGB1，经鉴定表明获得了小鼠HMGB1的融合蛋白，为进一步探讨HMGB1对免疫细胞的调节及其在类风湿性关节炎中

6、的作用机制，寻找类风湿性关节炎治疗的新途径奠定了基础。1材料与方法1.1材料大肠埃希菌Rossta，DH5α，质粒pET28a(+)为本室保存；Trizol购自Invitrogen公司；DNAGelExtractionKit、各种限制性内切酶、T4DNA连接酶、rTaq酶、pMD18T载体购自TaKaRa宝生物工程(大连)有限公司；AMVReverseTranscriptase，RNaseInhibitor均购自Sigma公司;鼠抗HisTag单克隆抗体购自Omiga公司;HisTrapHP购自GEHealthcare公司。1.2方法1.2.1PCR引物和设计根据基因库中小鼠HMG

7、B1mRNA序列，设计编码区的特异性引物：上游引物序列为P1:5′CGAGCTCATGGGCAAAGGAGATCCT3′,下游引物序列为P2：5′CCAAGCTTTTATTCATCATCATCATC3′，在上下游引物5′端分别插入SacⅠ8和HindⅢ酶切位点和保护碱基，以便于酶切、克隆。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。1.2.2总RNA的提取及RTPCR颈椎脱臼处死成年小鼠，无菌取脾脏，经充分研磨过滤后，用T