提取方法与部位对浙贝母基因组DNA提取质量的影响.doc

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1、提取方法与部位对浙贝母基因组DNA提取质量的影响　　摘要：探讨了改良ＣＴＡＢ法、ＳＤＳ法、高盐低ｐＨ法和试剂盒法对浙贝母基因组ＤＮＡ的提取效果。综合比较了各方法提取的ＤＮＡ浓度、纯度、完整性，结果表明高盐低ｐＨ法是比较适合浙贝母新鲜叶片基因组ＤＮＡ提取的方法。比较了分别以叶片和鳞茎为材料提取的ＤＮＡ质量，发现以新鲜叶片为材料提取的ＤＮＡ浓度和纯度较高，更适合用于提取浙贝母基因组ＤＮＡ。　　关键词：浙贝母；基因组ＤＮＡ；提取　　中图分类号：Ｓ５６７．２３＋１文献标识码：Ａ文章编号：0439－８11421－4503-03　　　　ＥｆｆｅｃｔｓｏｆＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＭｅｔｈｏｄａｎｄＴｉｓｓｕ

2、ｅｓｏｎｔｈｅＱｕａｌｉｔｙｏｆＧｅｎｏｍｉｃＤＮＡ　　ｉｎＦｒｉｔｉｌｌａｒｉａｔｈｕｎｂｅｒｇｉｉ　　　　ＺＨＯＵＪｉｅ１，ＷＡＮＧＸｉａｏ－ｆｅｉ２，ＪＩＮＸｉａｏ－ｘｉａ２，ＷＡＮＧＺｈｏｎｇ－ｈｕａ２　　　　　　Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＭｏｄｉｆｉｅｄＣＴＡＢｍｅｔｈｏｄ，ｈｉｇｈｓａｌｔｌｏｗｐＨｍｅｔｈｏｄ，ＳＤＳｍｅｔｈｏｄａｎｄＤＮＡＭｉｎｉ－ｐｒｅｐｋｉｔｍｅｔｈｏｄｗｅｒｅｕｓｅｄｔｏｅｘｔｒａｃｔｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡｆｒｏｍＦｒｉｔｉｌｌａｒｉａｔｈｕｎｂｅｒｇｉｉＭｉｑ．Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｔｈｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ，ｐｕｒｉｔｙａｎ

3、ｄｉｎｔｅｇｒｉｔｙｏｆｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡｅｘｔｒａｃｔｅｄｂｙｖａｒｉｏｕｓｍｅｔｈｏｄｓshowedｔｈａｔｈｉｇｈｓａｌｔｌｏｗｐＨｍｅｔｈｏｄｗａｓｔｈｅｓｕｉｔａｂｌｅｍｅｔｈｏｄｆｏｒｅｘｔｒａｃｔｉｎｇＤＮＡｆｒｏｍＦ．ｔｈｕｎｂｅｒｇｉｉ．ＣｏｍｐａｒｉｓｏｎｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅＤＮＡｅｘｔｒａｃｔｅｄｆｒｏｍｆｒｅｓｈｌｅａｖｅｓａｎｄｂｕｌｂｒｅｖｅａｌｅｄｔｈａｔＤＮＡｏｂｔａｉｎedｆｒｏｍｆｒｅｓｈｌｅａｖｅｓｗａｓｗｉｔｈｈｉｇｈｅｒｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎａｎｄｐｕｒｉｔｙ，ｔｈｕｓｆｒｅｓｈｌｅａｖｅｓｗｅｒｅｂｅｔｔｅｒｍａｔｅｒｉａｌsｆｏｒＤＮＡｅ

4、ｘｔｒａｃｔｉｏｎｏｆＦ．ｔｈｕｎｂｅｒｇｉｉ．　　Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ＦｒｉｔｉｌｌａｒｉａｔｈｕｎｂｅｒｇｉｉＭｉｑ．；ｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ；ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　　　　浙贝母是百合科贝母属的多年生草本植物，又名象贝、大贝、珠贝、土贝、元宝贝、苏贝。浙贝母的鳞茎干燥，性苦、寒，具有清热散结、化痰止咳、开郁之功效，是较为常用的中药材，也是著名的“浙八味”之一［１］。ＤＮＡ的提取是进行各种分子生物学实验的基础，提取的ＤＮＡ浓度和质量对后续实验结果有较大的影响。而中药材中含有丰富的次生代谢产物，使其ＤＮＡ提取较为困难，有顽拗植物之称［２］。本研究比较了用不同方法从中药材浙贝母的新鲜叶片和鳞茎中

5、提取基因组ＤＮＡ的效果，从中找出简单高效的方法，以为开展浙贝母种质资源的遗传多样性分析及其分子鉴定奠定基础。　　１材料和方法　　１．１材料　　材料采集地点为浙江省宁波市鄞州区章水镇，２０１０年３月２０日采集宽叶浙贝母、狭叶浙贝母、多子浙贝母三个品种的新鲜嫩叶，２０１０年１０月５日采集多子浙贝母的鳞茎用于实验。　　１．２方法　　１．２．１材料的预处理　　１）叶片：将新鲜叶片洗净擦干后剪碎，放入预冷的研钵中，加入适量的ＰＶＰ提取液以及２％的β－巯基乙醇进行快速研磨。研磨成均匀的糊状后取适量分装入１．５ｍＬ的离心管中，待用。　　２）鳞茎：①将鳞茎去皮洗净后切成细小的状块，放入预冷的研钵中，加入适

6、量的ＰＶＰ提取液以及２％的β－巯基乙醇进行快速研磨。研磨成均匀的糊状后取适量分装入１．５ｍＬ的离心管中，待用；②将鳞茎去皮洗净后烘干，用万能粉碎机研磨成细粉状，称取适量到离心管中，待用。　　１．２．２基因组ＤＮＡ提取以多子浙贝母叶片为材料，考察ＣＴＡＢ法、高盐低ｐＨ法、ＳＤＳ法和试剂盒法对浙贝母基因组ＤＮＡ的提取效果；并考察高盐低ｐＨ法对不同浙贝母品种和部位基因组ＤＮＡ的提取效果。各ＤＮＡ提取方法如下：　　１）ＣＴＡＢ提取法［３，４］：①向装有浙贝母材料的离心管中加入８００μＬ预热的ＣＴＡＢ提取缓冲液，混匀后６５℃水浴１ｈ，１２０００ｒ／ｍｉｎ离心１５ｍｉｎ；②取上清，加入等体积的氯仿／异

7、戊醇轻轻混匀，１２０００ｒ／ｍｉｎ离心１５ｍｉｎ，重复此步骤一次；③取上清，加入２／３体积的异丙醇，放入　　－２０℃冰箱４０ｍｉｎ以沉淀ＤＮＡ；④加入２００μＬ７０％乙醇洗涤ＤＮＡ２～３次；⑤将离心管倒置于通风柜里，使ＤＮＡ尽量干燥；⑥加入２０μＬＴＥ溶解ＤＮＡ，４℃保存备用。　　２）高盐低ｐＨ法：①向装有浙贝母材料的离心管中加入８００μＬ预热的提取缓冲液，５６℃水浴３０ｍｉｎ；②１００００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，取上