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时间:2020-04-29
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1、提取方法与部位对浙贝母基因组DNA提取质量的影响 摘要:探讨了改良CTAB法、SDS法、高盐低pH法和试剂盒法对浙贝母基因组DNA的提取效果。综合比较了各方法提取的DNA浓度、纯度、完整性,结果表明高盐低pH法是比较适合浙贝母新鲜叶片基因组DNA提取的方法。比较了分别以叶片和鳞茎为材料提取的DNA质量,发现以新鲜叶片为材料提取的DNA浓度和纯度较高,更适合用于提取浙贝母基因组DNA。 关键词:浙贝母;基因组DNA;提取 中图分类号:S567.23+1文献标识码:A文章编号:0439-811421-4503-03 EffectsofExtractionMethodandTissu
2、esontheQualityofGenomicDNA inFritillariathunbergii ZHOUJie1,WANGXiao-fei2,JINXiao-xia2,WANGZhong-hua2 Abstract:ModifiedCTABmethod,highsaltlowpHmethod,SDSmethodandDNAMini-prepkitmethodwereusedtoextractgenomicDNAfromFritillariathunbergiiMiq.Comprehensivecomparisonoftheconcentration,purityan
3、dintegrityofgenomicDNAextractedbyvariousmethodsshowedthathighsaltlowpHmethodwasthesuitablemethodforextractingDNAfromF.thunbergii.ComparisonbetweentheDNAextractedfromfreshleavesandbulbrevealedthatDNAobtainedfromfreshleaveswaswithhigherconcentrationandpurity,thusfreshleaveswerebettermaterialsforDNAe
4、xtractionofF.thunbergii. Keywords:FritillariathunbergiiMiq.;genomicDNA;extraction 浙贝母是百合科贝母属的多年生草本植物,又名象贝、大贝、珠贝、土贝、元宝贝、苏贝。浙贝母的鳞茎干燥,性苦、寒,具有清热散结、化痰止咳、开郁之功效,是较为常用的中药材,也是著名的“浙八味”之一[1]。DNA的提取是进行各种分子生物学实验的基础,提取的DNA浓度和质量对后续实验结果有较大的影响。而中药材中含有丰富的次生代谢产物,使其DNA提取较为困难,有顽拗植物之称[2]。本研究比较了用不同方法从中药材浙贝母的新鲜叶片和鳞茎中
5、提取基因组DNA的效果,从中找出简单高效的方法,以为开展浙贝母种质资源的遗传多样性分析及其分子鉴定奠定基础。 1材料和方法 1.1材料 材料采集地点为浙江省宁波市鄞州区章水镇,2010年3月20日采集宽叶浙贝母、狭叶浙贝母、多子浙贝母三个品种的新鲜嫩叶,2010年10月5日采集多子浙贝母的鳞茎用于实验。 1.2方法 1.2.1材料的预处理 1)叶片:将新鲜叶片洗净擦干后剪碎,放入预冷的研钵中,加入适量的PVP提取液以及2%的β-巯基乙醇进行快速研磨。研磨成均匀的糊状后取适量分装入1.5mL的离心管中,待用。 2)鳞茎:①将鳞茎去皮洗净后切成细小的状块,放入预冷的研钵中,加入适
6、量的PVP提取液以及2%的β-巯基乙醇进行快速研磨。研磨成均匀的糊状后取适量分装入1.5mL的离心管中,待用;②将鳞茎去皮洗净后烘干,用万能粉碎机研磨成细粉状,称取适量到离心管中,待用。 1.2.2基因组DNA提取以多子浙贝母叶片为材料,考察CTAB法、高盐低pH法、SDS法和试剂盒法对浙贝母基因组DNA的提取效果;并考察高盐低pH法对不同浙贝母品种和部位基因组DNA的提取效果。各DNA提取方法如下: 1)CTAB提取法[3,4]:①向装有浙贝母材料的离心管中加入800μL预热的CTAB提取缓冲液,混匀后65℃水浴1h,12000r/min离心15min;②取上清,加入等体积的氯仿/异
7、戊醇轻轻混匀,12000r/min离心15min,重复此步骤一次;③取上清,加入2/3体积的异丙醇,放入 -20℃冰箱40min以沉淀DNA;④加入200μL70%乙醇洗涤DNA2~3次;⑤将离心管倒置于通风柜里,使DNA尽量干燥;⑥加入20μLTE溶解DNA,4℃保存备用。 2)高盐低pH法:①向装有浙贝母材料的离心管中加入800μL预热的提取缓冲液,56℃水浴30min;②10000r/min离心10min,取上
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