沉默人肺癌A549细胞中期因子基因表达对细胞凋亡的影响.pdf

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1、6O8重庆医学2015年2月第44卷第5期论著·基础研究doi：10．3969／j．issn．1671—8348．2015．05．010沉默人肺癌A549细胞中期因子基因表达对细胞凋亡的影响孙常铭，王丽萍，刘敏，赵维川，朴宗方，张秀琴△(承德医学院附属医院检验科，河北承德067000)摘要：目的研究RNA干扰(RNAi)人肺癌A549细胞中期因子(MK)基因表达及对肿瘤细胞凋亡的影响。方法构建舍MKsiRNA真核表达载体，将其转染到人肺癌A549细胞株中(实验组)，另有阴性对照组(转染阴性对照质粒)和空白对照组。应用RT—PCR的方法检测各组细胞

2、中MKmRNA的表达情况；采用Westernblot法检测MK蛋白的表达情况；用流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况。结果实验组MK蛋白和mRNA表达都下降，分别下降了89．3和83．3。转染实验组A549细胞有自发性凋亡的发生，早期凋亡比阴性对照组和空白组分别提高了15．5倍和9．34倍。实验组caspase一3活性明显高于阴性对照组和空白对照组(Pd0．05)。结论RNAi下调人肺癌A549细胞株MK的表达，可诱导肿瘤细胞的自身凋亡。关键词：RNA干扰；细胞凋亡；A549；中期因子中图分类号：R734．2文献标识码：A文章编号：l671—8348(

3、2015)05—0608—02EffectsofsilencinglungcancerA549midkinegeneexpressiononcellapoptosisSunChangming，WangLiping，LiuMin，ZhaoWeichuan，PiaoZongfang，ZhangXiuqin(DepartmentofClinicalLaboratory，theAJ厂iliatedHospitalofChengdeMedicalCollege，Chengde，Hebei067000，China)Abstract：ObjectiveTost

4、udytheeffectsofmidkine(MK)byRNAiongeneexpressionandapoptosisinA549cel1．MethodsConstructMKsiRNAexpressionvector，andthenwastransfectedthatintoA549cells(positivegroup，negativegroup。blankcellgroup)．ExpressionofMKwasdeterminedbyRT—PCRandWesternblotineachgroup；apoptosiswasevaluated

5、byflowcytometry．ResultsTheexpressionofMKproteindeclined89．3andexpressionofmRNAdeclinded83．3inpositivegroup(positivegroup)．Spontaneousapoptosiswasdetetedinpositivegroup，earlyapoptosisincreasedby15．5timesand9．34timesthanthenega—tivecontrolgroupandblankgroup．Activitiesofcaspase一

6、3washigherthanothertwogroups(P％0．05)．ConclusionRNAicanin—hibitexpressionofMKandinduceapoptosisofA549cells．Keywords：RNAinterference；apoptosis；A549；midkine中期因子(MK)就是与肿瘤发生和发展有密切关系的基性抑制剂DEVD-CHO试剂盒(瑞士Bachem公司)。因。MK能调节细胞生长、存活和分化，并参与肿瘤发病过1．2方法程]。在许多不同类型的肿瘤中表达增强，包括食管癌、胃1．2．1MKs

7、RNA干

8、扰质粒的构建(1)siRNA的设计：根癌、结直肠癌、胰腺癌、胆囊癌、肺癌、甲状腺癌、乳腺癌、膀胱据GeneBankMK基因序列(NM001O12333)，结合MKtuRNA癌、子宫癌、卵巢癌、前列腺癌和肝癌、神经细胞瘤、恶性胶质的二级结构，设计了一条特异性的针对MK基因389～407bp瘤、髓系白血病]，阳性表达率45～9O，MK在正常组织的19nt的siRNA，序歹U为5f_GTACAAGTTTGAGAACTG中不表达或低表达_6]。所以，血清MK水平有望成为一个新G一3。BLAST分析排除其同源序列。(2)合成编码siRNA的的肿瘤标志物l_

9、7]。MK可以促进肿瘤血管的生成，增强肿瘤的DNA序列：结构CACC4-Sense4-Loop4-Antisense4-终止信耐药性，抑