人肺癌a549细胞凋亡相关基因的表达及意义论文

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1、人肺癌A549细胞凋亡相关基因的表达及意义论文李亚荣张捷夏大文唐艳石光刘冰【摘要】目的比较耐顺铂的人肺腺癌细胞(A549DDP)凋亡相关基因的表达与亲代A549细胞的差异，探讨细胞凋亡与细胞耐药的发生机制。方法应用OligoGEArray细胞凋亡基因芯片，检测A549和A549DDP细胞相关凋亡基因表达水平。结果A549DDP细胞表达BAD、BAG3、BFAR、CARD8、CASP6、GADD45、TNFRSF14、CD70、TRADD、TRAF1、TRAF3基因较亲代A549细胞显著增高(P0.05),二者比值上调2倍以上。结论肺腺癌A54

2、9DDP细胞过表达上述凋亡相关基因，可能是导致细胞凋亡受抑、细胞耐药的主要原因。【关键词】肺癌;凋亡基因;细胞凋亡;耐药细胞耐药是导致化疗失败的主要原因。研究发现耐药的发生与细胞凋亡基因的异常表达密切相关。采用OligoGEArray细胞凋亡基因芯片方法检测细胞凋亡相关基因，具有敏感性高、速度快和重复性好等优点。目前尚未见以OligoGEArray细胞凋亡基因芯片方法检测A549细胞凋亡相关基因的报道。本文采用OligoGEArray细胞凋亡基因芯片检测人肺腺癌亲代细胞与耐顺铂细胞(A549和A549DDP)凋亡相关基因,并对检测结果的临床意

3、义进行初步分析，进一步探讨肿瘤细胞凋亡与耐药的发生机制。1对象与方法1.1对象人肺腺癌亲代A549细胞和耐顺铂的A549DDP细胞(华西医科大学新桥医院呼吸病研究所提供)。1.2方法1.2.1细胞培养人肺腺癌A549与A549DDP细胞,以含有10%胎牛血清的DMEM培养基在37℃、5%CO2条件下培养,每2～3d传代1次,初始密度为2×105/ml(2ml/6孔板)。取对数生长期细胞进行实验。1.2.2凋亡基因检测按着OligoGEArray基因芯片实验操作步骤进行(OligoGEArray细胞凋亡基因芯片由上海康成生物科技有限公司提供)。

4、1.2.3RNA抽提Trizol一步法进行细胞总RNA的抽提。1.2.4RNA质量检测经变性琼脂糖凝胶电泳及紫外吸收测定法对RNA质量进行检测。1.2.5cRNA标记与合成首先合成cDNA，再合成cRNA，并对合成的cRNA进行标记和扩增.freelains，SODD)。在非配体存在的情况下，SODD与TNFR1胞浆段的死亡结构域预先结合，形成SODDTNFR1复合体，该复合体不能与含有死亡结构域的TNFR1结合蛋白(TNFR1associateddeathdomainprotein，TRADD)等相互作用，TNFR1信号通路处于失活状态

5、。给予TNF刺激后，SODD从复合体中脱落，TNFR1信号通路被打开〔4〕。首先，TRADD与TNFR1通过死亡结构域之间的作用相互结合，然后TRADD作为一个衔接平台，进一步募集其他信号分子至激活受体，从而决定细胞生存与死亡。受体作用蛋白(receptorinteractingprotein，RIP)通过死亡结构域与TRADD结合,可进一步激活TNFR相关因子2(TNFRassociatedfactor2，TRAF2)，活化的TRAF2再激活2个独立的信号传导途径：(1)可通过磷酸化作用激活NFκB诱导激酶，继而活化κB激酶复合物抑制

6、蛋白，导致其降解从而失去对NFκB的抑制，NFκB转位至细胞核激活多种基因的转录，主要包括抗凋亡基因如细胞凋亡抑制蛋白基因1、2，B细胞淋巴瘤2基因,.freelinalkinase，JNK)，通过JNK/SAPK途径抗凋亡〔5，6〕。肿瘤坏死因子受体超家族14(TNFRSF14)，通过细胞表面受体信号连接转导途径，活化caspase抑制剂，抑制活化的caspase，释放螯合的细胞质中的NFk颗粒，参与细胞凋亡。caspase家族是一组与细胞凋亡有关的蛋白酶，包括很多成员,本实验中涉及的CARD6、CARD8、CASP6均属casp

7、ase家族。化疗药物引起的细胞凋亡均须激活caspase。caspase蛋白酶在死亡受体介导的细胞凋亡中起着中心的作用。其中caspase8(CARD8)是这一凋亡过程中首先被活化的ICE家族蛋白酶。由于caspase8具有FADD样DED结构域，并且能够通过DED结构域与FADD结合，所以caspase8可以在凋亡过程中间接与细胞膜受体发生联系，从而将细胞膜事件转化为细胞浆事件。caspase8活化后，一方面它可以剪切活化caspase3、caspase7、caspase4、caspase9和caspase10，通过这些蛋

8、白酶剪切底物使凋亡得以进行;另一方面，它的活性可以被CrmA所抑制，籍此可作为细胞凋亡负调控因素作用的环节。caspase6具有活化水解酶、水解蛋白和分解肽作用，