超声微泡造影剂对人肝癌 HepG2细胞活性的影响.pdf

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1、广东医学2015年3月第36卷第5期GuangdongMedicalJournalMar．2015，Vo1．36，No．5·683·超声微泡造影剂对人肝癌HepG2细胞活性的影响木潘丽雯，过新民，赖己创，阮黎，谷英士暨南大学医学院附属第四医院、广东省广州市红十字会医院内分泌科，超声诊断科，泌尿外科(510220)【摘要】目的观察超声六氟化硫(s)微泡对人肝癌HepG2细胞的细胞毒性作用，筛选最优微泡转染浓度。方法应用噻唑蓝(MaS)比色分析与台盼蓝染色两种方法检测S对人肝癌HepG2细胞活性的影响。结果当微泡造影剂浓度小于10％时，不同浓度的SF6均不会引起

2、明显的细胞死亡(细胞存活率>80％)；随着微泡浓度增高，细胞活性下降，各组间比较差异有统计学意义(P<0．05)；当微泡浓度达20％时，其对细胞的杀伤力明显增强(细胞存活率<70％)。结论M1T和台盼蓝法检测显示，当微泡造影弃l浓度小于10％时，S不会引起明显的细胞死亡，可作为最优细胞转染浓度进行后续研究。【关键词】超声微泡；六氟化硫；HepG2细胞Et前，从基因水平上对人肝癌靶向治疗的研究已胞，在37~C的水浴条件下1min使冻存液快速溶化，然经开展，其中载体是实验中的关键环节，基因治疗的传后将细胞移至离心管中，加入新鲜无血清DMEM培养统载体主要有病毒型

3、及非病毒型两类，其特点不一，不液中，800r／min离心5min，弃上清液，加入含10％足之处主要表现在基因转染效率较低或缺乏靶向性以FBS的DMEM完全培养液混匀，移至培养瓶中37℃、及安全隐患等问题。近年来随着超声造影技术飞速发5％CO，饱和湿度培养箱中常规培养，第2天换液及观展，超声微泡作为一种新型载体，在空化效应下微泡破察生长情况。裂可以达到靶向、安全、高效的治疗作用⋯。但该技术细胞培养与传代：HepG2细胞置于含10％FBS的所受的影响因素较多，需要对超声频率、微泡、基因携DMEM细胞培养液中，于37~C、5％CO：条件下放置培带方式等参数条件进行

4、优化-3]。2013年9月至2014养箱中，隔天换液。对数生长期汇合度大于80％可以年3月本实验拟探讨微泡对HepG2细胞活性的影响，传代，4mLPBS清洗两次，每2～4d，用0．25％胰蛋白为后续实验提供最优微泡转染浓度。酶消化细胞1～2min，800r／min离心5min，弃上清液，1材料与方法以1：3的比例传代培养。1．1仪器与方法HepG2细胞(Hyclone公司)，注射细胞冻存：采用对数生长期的细胞，去除培养瓶中用六氟化硫(SF)微泡(BraccoSuisseSA)，DMEM(高旧的培养基，加入4mLPBS冲洗2次，0．25％胰蛋白糖)、PBS、F

5、BS(Hyclone公司)，噻唑蓝(MTT)(Gen—酶消化细胞1—2min，移至离心管中，800r／min离心view)，台盼蓝(Sigma公司)，细胞培养箱(Thermo公5min，弃上清液，加入配制好的冻存液(50％FBS，40％司)，倒置显微镜及显微成像系统(ZEISS)，超净工作培养液，10％二甲基亚砜)均匀混合，移至无菌冻存管台(上海一恒科学仪器有限公司)。中，细胞数约(0．5～1)×10·mL～，4℃放置30min，1．2细胞培养一20℃放置1～2h，一80℃冰箱12h，最后置于液氮1．2．1培养液体配制DMEM培养液配制：取1袋罐中。DMEM

6、(HycloneSH30026．01B)溶解于终体积一半的1．3实验方法三蒸水中，水洗包装袋内面2次，倒入培养液中并加水1．3．1M1Tr比色法检测不同微泡浓度对细胞活性的至1L，NaHCO33．7g／L，青霉素0．06g／L，链霉素0．13影响0．25％胰蛋白酶消化HepG2细胞形成单细胞g／L，磁力搅拌器搅拌使其充分溶解，pH值调至7．2～悬液，调整细胞浓度为1×10·mL～，每孔100接7．4，0．22m滤膜抽滤除菌，分装于无菌血清瓶中，种于96孔培养板中，细胞培养箱内培养24h，弃上清4℃保存冰箱备用。PBS配制：8．0g／LNaC1，0．20g／L

7、液。分组如下：实验组(4个)：1、2、3、4组各加入1％、KC1，1．56g／LNa2HPO4·H20，0．20g／LKH2PO4的蒸5％、10％、20％浓度的s微泡；对照组：只接种细胞，馏水溶液，调节pH值至7．2～7．4，加蒸馏水定容至不给予微泡处理；空白组(即调零组)：不加细胞，只加1L，高压蒸汽灭菌30min，保存于室温或4~C冰箱中。培养液。每组设6个平行复孔，各组均做3次重复。1．2．2培养方法细胞复苏：于液氮罐中取出冻存细1．3．2超声微泡造影剂的准备注射用s微泡制备：在使用前向小瓶内注入注射用生理盐水，即0．9％广东省社会发展领域科技计划项目

8、(编号：20120318079)的无菌氯化钠注射液5