靶向ezrin、radixin、moesin的siRNA慢病毒感染原代肺微血管内皮细胞促进流感病毒的复制.pdf

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1、456细胞与分子免疫学杂志(ChinJCellMolImmuno1)2015，31(4·论著·文章编号：1007—8738(2015)04—0456—06靶向ezrin、radixin、moesin的siRNA慢病毒感染原代肺微血管内皮细胞促进流感病毒的复制吴莹，张淑静，张晨月，玄子男，李姝玉，高誉珊，胡雨(北京中医药大学基础医学院医学病原系，北京100029；上海市复旦大学附属肿瘤医院中西医结合科，上海200032)[摘要]目的构建分别靶向ezrin(E)、radixin(R)、moesin(M)的siRNA慢病毒表达载体，转染原代大鼠

2、肺微血管内皮细胞，观察其对E、R、M基因表达及流感病毒复制的影响。方法根据siRNA设计原理，化学合成靶向大鼠E、R、M基因的siRNA序列，克隆入J慢病毒表达质粒GV248，构建分别靶向E、R、M基因的慢病毒siRNA载体k一E—siRNA、Lend．R．siRNA、Lenti．M．siRNA，同时构建靶向无关序列的Lenti—control-siRNA；组织块法分离培养大鼠原代肺微血管内皮细胞(PMVEC)；Lenti．E．siRNA、Lenti—R—siRNA、Lenti—M—siRNA转染原代大鼠PMVEC后，荧光定量PCR检测E

3、、R、M的mRNA的表达，Westernblot法检测ERM蛋白的表达，激光共聚焦显微镜技术检测ERM蛋白的分布；FM1流感病毒鼠肺适应株感染慢病毒转染的PMVEC后，荧光定量PCR检测慢病毒载体对流感病毒复制的影响。结果重组质粒经测序鉴定，Lenti．E．siRNA、Lenti．R．siRNA、Lenti．M．siRNA、Lenti—control—siRNA构建成功。慢病毒载体转染大鼠PMVEC，感染复数(MOI)为10时感染率达80％以上。k．E．siRNA、Lenti—R—siRNA、Lenfi—M—siRNA明显抑制PMVEC中

4、E、R、M的转录及表达。流感病毒感染PMVEC中，慢病毒空载体及Lenti—control—siRNA抑制流感病毒的复制，而Lenti-E-siRNA、Lenti．R．siRNA、Lenti．M．siRNA增加PMVEC中流感病毒的mRNA水平。结论成功构建靶向ERM基因的慢病毒载体，证实其可稳定转染PMVEC特异高效地抑制E、R、M基因表达；慢病毒载体本身能抑制PMVEC中流感病毒复制，而靶向E、R、M的慢病毒siRNA却促进流感病毒的复制。【关键词】小干扰RNA；ezrin；radixin；moesin；肺微血管内皮细胞；流感病毒；复

5、制[中图分类号]Q291，R373[文献标志码]AThetransfectionoflentiviralsiRNAvectorstargetingezrin，radixinandmoesinfacilitatesinfluenzavirusreplicationinprimarypulmonarymicrovascularendothelialcellswuYing，ZHANGShujing，ZHANGChenyue，XUANZinan，LIShuyu，GAOYushan，HUYuDepartmentofMicrobiologyandIm

6、munology，SchoolofBasicMedicalSciences，BeijingUniversityofChineseMedicine，Beijing100029；DepartmentofIntegrativeOncology，ShanghaiCancerCenter，FudanUniversity，Shanghai200032，China【AbstractjObjectiveToconstructlentivirussiRNAvectorstargetingezrin(E)，radixin(R)andmoesin(M)，tra

7、nsfectratprimarypulmonarymicrovascularendothelialcells(PMVECs)withthevectorsandobservetheefectsofthetransfectiononE，R，Mgeneexpressionsandinfluenzavirusreplication．MethodsAccordingtotheprinciplesofsiRNAsynthesis，siRNAsequencestargetingE。RandMgenesweresynthesizedandclonedin

8、tolentiviralplasmidGV248toconstructlentiviralsiRNAvectorsLenti-E—siRNA，Lenti-R-siRNAandLenti-M-s