阿维菌素类药物单克隆抗体的制备和鉴定.pdf

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1、畜牧兽医饲料兽药阿维菌素类药物单克隆抗体的制备和鉴定1-nI方洋’，裴道国，万宇平，周红娟2冯才伟，许美玲(1．北京望尔生物技术有限公司，北京102206；2．山东临沂出入境检验检疫局，山东临沂273300)中图分类号$859．7文献标识码A文章编号1672—9692(201O)07—0048—041⋯‘⋯”-⋯’-⋯。●⋯‘-⋯。●⋯‘-⋯‘●⋯-⋯-⋯’●⋯。-⋯‘●⋯‘-⋯‘●⋯’●⋯‘●⋯●⋯‘●⋯’●⋯‘●⋯。●⋯’●⋯’●⋯。●⋯’●⋯‘●⋯‘●⋯‘●⋯‘●⋯●⋯’●⋯·●⋯·●⋯·●⋯·●⋯·●⋯‘●⋯·●⋯·●⋯·●一··●⋯·●‘：：[摘要]将

2、阿维菌素与牛血清白蛋白偶联，免疫Balb／c小鼠，用杂交瘤技术获得了1株分泌抗阿：维菌素特异性抗体的杂交瘤细胞株。用间接ELISA测定腹水的效价为1：160ooo，抗体的50％抑制药：÷物浓度(Ic。)为2．5ng／ml，抗体与伊维菌素的交叉反应为12．5％，与多拉菌素、莫西菌素均无交叉反应。；：[关键词]阿维菌素；单克隆抗体；间接竞争ELISA?；?：●⋯-●⋯．●⋯．●⋯．●⋯．●⋯．●⋯．●⋯．●⋯．●⋯．●⋯．●⋯．●⋯．●⋯．●⋯．●⋯．●⋯．●⋯。●⋯．-⋯．●⋯．●⋯+●⋯．●⋯．·⋯．●⋯．-⋯．●⋯．-⋯．●⋯．·⋯．·⋯．-⋯一⋯-⋯．·⋯．

3、·⋯一⋯n⋯一⋯．⋯一⋯．⋯．阿维菌素类药物(avermectins，AVMs)是由放2．1人工抗原的合成用琥珀酸酐制备含有阿线菌产生的一组大环内酯类抗生素，包括阿维菌素维菌素(AVM)特征结构的半抗原5一(O)一单保护~vermectin，AVM)、伊维菌素(ivermectin，IVM)、琥珀酰AVM，用CDI的方法将半抗原与载体蛋多拉菌素(doramectin，DOR)、埃普里诺菌素白(BSA、OVA)相偶联，合成人工抗原。AVM—(eprinomectin，EPR)、埃玛菌素(emamectin，BSA作为免疫原免疫小鼠，AV—OVA作为包被原EMM)、

4、莫西菌素(moxidectin，MOX)和塞拉菌素用于筛选和检测。(selamectin，SEM)等，作用机制独特，杀虫活性2．2阿维菌素抗血清的制备取8周龄的雌性强和杀虫谱广，对线虫和体外节肢动物有较强的Balb／c小鼠，以每只0．1ml(5O计算BSA—AVM驱杀作用口-5]。但是AVMs作为脂溶性化合物，在量，加等体积完全福氏佐剂制成乳化剂，于小鼠动物体内残留时间较长，因而WHO将其列为高的颈背部皮下多点注射，进行初次免疫；间隔1毒化合物，其动物源食品中的残留检测工作引起月后，取同样量免疫抗原加不完全福氏佐剂，同各国的极大关注。目前，AVM残留的检测方法法

5、进行再次免疫；以后每隔1月取同样免疫抗原仍以Pivnichny等建立的荧光衍生化试剂检测为加不完全佐剂，同法进行加强免疫。2免后10d基础的高效液相色谱法(HPLC)为主嘲，需要昂贵的采血，用间接ELISA测定抗体效价，选择最佳剂大型仪器设备，检测成本高，在中小型企业难以量反应曲线者用予细胞融合。融合前3d给小鼠推广。因此，有必要建立一种快速、灵敏、检测经腹腔注射50IxgBSA—AVM免疫抗原进行加强成本低的用于监控AVM残留的检测方法。本研免疫。究旨在制备针对AVM的单克隆抗体，以此为核2．3间接竞争ELISA方法建立第3次免疫I周心试剂建立检测动物组织中A

6、VM残留的ELISA后采血，用间接ELISA方法测定血清效价。①包快速检测试剂盒技术。被：用包被液将AVM—OVA抗原稀释成一定浓度1材料100l／孔加至酶标板，37cc孵育2h，4qC过夜；Balb／c小鼠，SP2／0细胞均由北京望尔生物②洗涤：250t,1／：~L，间隔1rain，在吸水纸上拍技术有限公司提供。干；③封闭：封闭液150l／孔，37oC孵育lh后2方法拍干；④加样：加入系列稀释的AV标准品5O孔，再加入适当稀释的抗体50~V；／L，37oC孵育[收稿日期]2010—05—122010。07畜牧兽医饲；I；il兽药1h；250蚜L洗涤液洗5遍，每

7、次问隔15～：30S，价。结果见图1。拍干；⑤加二抗：加入HRP一羊抗鼠IgG(1：5000稀释)100l／孔，37℃孵育30min；洗涤同④；⑥显色：分别加入50lA、B液／孔，37℃恒温闭光显色15rain；⑦终止：加入2MH2SO50l／孔。用酶标仪读取各孔OD45o，以待测孔OD4so值高于阴性对照4倍以上或阳性值大于1．5以上者定为阳性孔I8J。-图1抗血清效价测定2．4杂交瘤细胞的制备和筛选取免疫鼠的脾3．3按照免疫程序免疫5只鼠，采血检测，5细胞嘲，按5：l比例与SP2／0骨髓瘤细胞融合，以号鼠产生的抗体效价最高，经过间接竞争ELISA间接ELIS

8、A筛选阳性孔，采用有限稀