乙型肝炎病毒X蛋白致人肝癌细胞损伤中自噬的机制-论文.pdf

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1、·1372·中华实验外科杂志2014年6月第31卷第6期ChinJExpSurg，June2014，Vo1．31，No．6·简手艮·乙型肝炎病毒x蛋白致人肝癌细胞损伤中自噬的机制王鹏王志伟钱海鑫郭青松周纯近年来，很多证据表明乙型肝炎病表达载体，48h后加入MG132进行筛选，0．065)、p-Akt／Akt(对照组灰度值0．780±毒x蛋白(HBx)在原发性肝癌发生发展每3d换液，约2个月时得到单个克隆，0．057，转染组灰度值0．470±0．061)表达中发挥至关重要的作用⋯。本研究旨在继续加压培养，直至长满培养皿。均出现下降。

2、探讨HBx引起HepG-2细胞自噬上调的3．Westernblot法检测LC3—11、LC3一I3．使用mTOR抑制剂Rapamycin后，相关分子机制，现报道如下。蛋白表达水平：细胞中加入预冷的HBx稳定转染的HepG2细胞兔多克隆微一、材料与方法10mmol／L磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤2管相关蛋白轻链抗体lI／I(LC31／／LC3I)1．材料：Hep．G2细胞(中国科学次，加人十二烷基硫酸钠(SDS)裂解液表达(对照组灰度值0．550±0．069，转染院)；含乙肝病毒HBx基因的表达质粒均匀的覆盖在细胞表面，冰浴20min

3、后组灰度值0．760±0．058)上调，mTOR表pcDNA3．1-HBx(上海博升生物科技有限刮下细胞，收集到1．5ml的离心管中，煮达(对照组灰度值0．830±0．073，转染组公司)；1640培养基(美国Gibco公司)；沸10min，接着以12000r／min离心灰度值0．650±0．069)下降。Hyclone胎牛血清(美国Hyclone公司)；10min，取上清一80保存。用改良的4．透射电镜观察使用mTOR抑制剂脂质转染试剂2000(美国Invitrogen公Lowry法定量蛋白后取等量的蛋白进行雷帕霉素后，HBx转

4、染的HepG一2细胞内司)；雷帕霉素、LY294002(美国Sigma公十二烷基硫酸钠(SDS)一聚丙烯酰胺凝胶自噬囊泡较对照组增多；使用PI3K／AKt司)；兔多克隆微管相关蛋白轻链抗体电泳。将胶上的蛋白转移到聚偏二氟乙抑制剂LY294002对HBx转染后HBx转(LC3)、兔单克隆哺乳动物雷帕霉素烯(PVDF)膜，以5％脱脂奶粉封闭后分染的HepG一2细胞内自噬囊泡亦较对照(mTOR)、磷脂酰肌醇激酶(PI3K)、丝氨别加一抗孵育12h，二抗孵育2h，最后用组减少。酸一苏氨酸激酶(Akt)抗体(美国CellSig．ECL发光系

5、统检测蛋白的表达水平。三、讨论nal公司)；辣根过氧化酶标记抗羊、兔、小4．透射电镜观察超微结构的影响：本研究结果显示，转染HBx的鼠二抗(美国Jackson公司)；Cy3标记抗取对数生长期对照组与HBx转染组的HepG一2细胞中，roTOR、PI3K及Akt的表羊二抗(美国SantaCruz公司)；4’，6一二HepG-2细胞，调整细胞浓度后接种于达均上调，说明HBx激活了PI3K／Akt／脒基一2一苯基吲哚(DAPI)(德国Serva公75ml培养瓶中，收集细胞，正常对照组用mTOR途径。进一步研究结果显示。电镜司)；二喹啉甲

6、酸(BCA)蛋白测定试剂盒、完全培养基培养24h。PBS离心洗涤1与Westernblot检测结果均表明使用ECL蛋白显色试剂盒(英国Pierce公司、次，1000r／min，10min，然后将细胞收集mTOR抑制剂雷帕霉素可增强HBx转染Rockford公司)。HeraeusBB16UV型C0，于1．5mlEP管中；每个EP管细胞加入后HepG2细胞的LC3Ⅱ／I的表达，细孵箱(德国Heraeus公司)；XDS一1B型倒lm12．5％戊二醛同定，于4℃保存，之后胞内自噬体形成增多。而PI3K／AKt抑置显微镜(重庆光学仪器厂)；

7、CM一120透送南通大学医学院电镜室固定、切片、摄制剂LY294002可下调HBx转染后射电镜(Philips，荷兰)。片。HepG一2细胞的LC3Ⅱ／I的表达，减少细2．HBx转染：细胞培养于含有10％5．统计学方法：应用SPSS11．5软件胞内自噬体的形成，说明HBx转染对细胎牛血清的DMEM培养基中，每3d传进行统计分析，计量资料以均数±标准胞内自噬的影响是通过调控PI3K／Akt／代。细胞长至90％融合时传代到6孔板差(x±S)表示，组间均数比较用t检验。mTOR途径实现的，可能与roTOR的中，贴壁过夜后，按照脂质转染试

8、剂2000二、结果FRB结构域有关。试剂说明书转染慢性乙肝病毒(HBV)过1．HBx稳定转染后的HepG一2细胞中参考文献mTOR(对照组灰度值0．450±0．098，转染[1]YooYG，ParkES，ChoH，eta1．HepatitisDOI