基于差异基因表达谱的慢性乙型肝炎病证结合研究-论文.pdf

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1、2014年9月第31卷第5期广州中医药大学学报September2014，Vo1．31，No．5JournalofGuangzhouUniversityofTraditionalChineseMedicine693．临床研究．基于差异基因表达谱的慢性乙型肝炎病证结合研究管艳，苏式兵，毛海琴(1．广州中医药大学，广东广州510405；2．上海中医药大学中医复杂系统研究中心，上海201203；3．云南中医学院第一附属医院，云南昆明650021)摘要：【目的】通过检测分析慢性乙型肝炎(简称乙肝)典型证候的差异基因表达谱，探讨乙肝中医证候分型与基因表达之间的关联。【方法】采集乙

2、肝患者和健康者的外周血样本，提取白细胞中的总RNA；运用基因芯片技术检测基因表达，并对其表达谱进行比较分析；使用实时定量RT—PCR验证部分基因表达。【结果】乙肝患者与健康者之间以及乙肝肝郁脾虚证、湿热蕴结证和肝肾阴虚证3个证候的患者之间的基因表达谱均存在明显差异对3个证候组相对于健康组的差异表达基因进行差异基因、聚类、功能(geneontology，GO)分析和信号传导通路(Pathway)分析发现，肝郁脾虚证单独调变的基因主要与细胞动力学过程等有关：湿热蕴结证单独调变的基因主要与脂质储存的正向调节等有关：肝肾阴虚证单独调变的基因主要与氮氧化合物合成酶调节物活性等有关

3、采用实时定量RT—PCR验证部分基因的表达．结果与基因芯片检测结果趋势基本一致。【结论】乙肝肝郁脾虚证、湿热蕴结证和肝肾阴虚证患者白细胞具有特征性的基因表达谱和显著性差异表达基因，提示乙肝中医临床辨证分型具有分子生物学物质基础关键词：乙型肝炎；中医证候；病证结合；基因；基因表达谱中图分类号：R259．126文献标志码：A文章编号：1007—3213(2014)05—0693—06DoI：10．13359／j．cnki．gzxbtcm．2014．05．002慢性乙型肝炎(简称乙肝)是由乙肝病毒结果报道如下。(HBV)引起的一种世界性传染性疾病。我国属HBV感染的高发区．乙

4、肝患者约有3000万．乙1对象与方法肝已经成为严重的临床和公共卫生问题[中医通1．1研究对象过辨证施治治疗乙肝有着独特的作用．而确定中医本研究用于芯片检测的为9例乙肝患者(肝郁证型是中医辨证施治的前提因此。对乙肝进行中脾虚证3例、湿热蕴结证3例、肝肾阴虚证3例)医辨证客观化、规范化的研究具有重要意义。随着和3例健康者：用于验证芯片结果的为30例乙肝系统生物学研究和组学检测技术的发展．运用大规患者(肝郁脾虚证1O例、湿热蕴结证1O例、肝肾模、高通量的基因芯片检测技术，对乙肝证候的基阴虚证10例)和10例健康者。乙肝患者均来自上因表达谱进行定量分析．阐明证候分型的分子生物海

5、中医药大学附属龙华医院．健康者来自健康志愿学基础．已成为可能．也是我们研究证候客观化的者．并签署知情同意书基础工作之一因此．本研究采集健康者和乙肝31．2诊断标准种典型证候(肝郁脾虚证、湿热蕴结证、肝肾阴虚慢性乙型肝炎诊断和分期标准参照中华医学会证)的临床信息和血液样本，采用生物芯片技术，肝病学分会、感染病学分会制订的《慢性乙型肝炎检测并分析健康者和乙肝不同证候的差异表达基因防治指南》l2l。证候诊断标准参照中华中医药学会及其表达谱．试图从基因转录组学阐释乙肝与健康内科肝病委员会提出的《病毒性肝炎中医辨证标准者之间、乙肝不同证候发生发展的生物学基础．从(试行)》[。基因

6、水平对乙肝进行“病证结合”研究．以探讨乙1．3标本采集肝与健康者及乙肝不同证候之间的差异。现将研究采集乙肝患者及健康者晨起空腹静脉血3mL，收稿日期：2014—．04．24作者简介：管艳(1985一)，女，2012级博士研究生；E-mall：guanyansue@163．con]通讯作者：毛海琴(1978一)，女，讲师；E-mail：Mao1978hq@163．com基金项目：国家科技重大专项课题(编号：2009ZX10004—601)694广州中医药大学学报2014年第3l卷保存于含有150ILL乙二胺四乙酸(EDTA)的个探针．可检测44049个基因使用GenePi

7、x2mL冻存管内．一20~C保存。4000B芯片扫描仪扫描芯片的荧光强度．并将实验1．4RNA抽提和质量检测结果转换成数字型数据保存．使用配套软件对原始采用TRIzolReagent(美国Invitrogenlife数据进行分析运算technologies公司)进行全血白细胞RNA提取和纯1．7芯片数据处理和分析化．操作流程严格按照试剂盒说明书进行。使用利用GenePix分析软件．对扫描的图像进行图NanoDropND一1000进行质量检测．D260／D280在像一数据的转换．剔除一些不可靠基因点值．包括1．8～2．1之间为合格剔除荧光值