树突状细胞体外刺激对hbv特异性细胞毒t细胞影响的研究

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1、树突状细胞体外刺激对HBV特异性细胞毒T细胞影响的研究张恒辉何豫赵鸿朴文花刘茂昌席宏丽于敏王贵强北京大学第一医院感染疾病科北大医院感染科张恒辉研究背景北大医院感染科张恒辉HBV慢性感染主要原因HBV特异细胞免疫功能的低下T细胞树突状细胞（DC）慢性乙型肝炎患者DC成熟、功能异常研究背景（1）特异性CTL数量少低反应HBV慢性感染主要原因HBV特异细胞免疫功能的低下T细胞树突状细胞（DC）慢性乙型肝炎患者DC成熟、功能异常促进DC成熟、恢复DC的功能增强DC激活特异性抗病毒免疫反应打破免疫耐受彻底清除病毒研究背景（1）特异性

2、CTL数量少低反应获得高频数、功能强HBV特异性的CTL促进DC成熟，增强DC功能CpGCD40LAd-IL-12转染Poly（I：C）关于恢复DC功能的研究研究背景（2）研究目的本研究通过在体外进行慢性乙型肝炎患者单核细胞的DC方向转化，并辅以聚肌胞Poly(I:C)刺激，增强DC的成熟和功能。将患者DC经HBVcore18-27肽负载后，刺激病人自身的T淋巴细胞。并用Elispot法及本研究室构建的HLA-A2肽四聚体复合物检测病毒特异性T淋巴细胞的数量和功能。研究对象和方法北大医院感染科张恒辉研究对象22例HLA-A

3、2+慢性乙型肝炎患者。HBeAg+患者16例、HBeAb+患者6例。HBVDNA均≥104copy/ml。排除HCV、HAV、HDV、HEV感染。近半年没有接受过抗病毒治疗。研究方法HLA-A2型别鉴定DC的体外培养扩增及鉴定以树突状细胞为抗原递呈细胞体外诱导病毒抗原特异性T细胞Elispot检测分泌IFN-γ的T细胞频数MHC-肽四聚体检测HBVcore18-27肽特异性CD8+T细胞HLA-A*02型别鉴定外周血淋巴细胞标记鼠抗人HLA-A02单抗；流式细胞仪检测；每份标本均设自身阴性对照。树突状细胞的体外培养扩增及鉴

4、定分离病人PBMC；GM-CSF、IL-4刺激下DC培养转化；Poly( I:C)刺激；通过流式细胞仪检测DC的HLA-DR、CD80、CD86、CD83、CD14等表面分子表达，进行功能及成熟度的鉴定。以DC为抗原递呈细胞体外诱导HBV抗原特异性T细胞培养成熟DC负载HBV核心肽（HBVcore18-27FLPSDFFPSV）；DC与自体T细胞共培养48-72h；单纯IL-2维持未经自身树突状细胞刺激T细胞组为对照。Elispot检测分泌IFN-γ的T细胞频数封闭种板孵育：37℃，5%CO2孵育15-20h；显色计数：C

5、TLIMMUNOSPOT分析仪计数，取两复孔的平均值MHC-肽四聚体检测HBVcore18-27肽特异性CD8+T细胞PE-HLA-A0201/HBVcore18-27tetramer和FITC-鼠抗人CD8标记；流式细胞仪检测；慢性乙型肝炎患者，采用HLA-0201/HCV四聚体标记作为阴性对照；统计学处理实验数据以x±SD表示。用SPSS10.0软件进行统计分析，组间比较用配伍组方差分析。结果北大医院感染科张恒辉DC的扩增、表型鉴定及Poly(I:C)对其表面分子表达的影响组别例数HLA-DR+CD80+CD83+C

6、D86+CD14+CD11c+未加Poly(I:C)组2283.6±6.923.4±6.619.3±2.284.2±6.38.4±2.895.5±3.1Poly(I:C)作用组2288.8±7.839.3±8.6*30.7±5.6*85.4±3.23.7±2.3*93.4±2.9慢性乙型肝炎病人DC经Poly(I:C)作用前后表面分子表达的比较*表示差异有统计学意义（P<0.01）经Poly(I:C)刺激后：CD80、CD83表达明显上调。CD14的表达明显下降。Poly(I:C)对DC表面分子表达的影响Elispot检测

7、HBV特异性的分泌IFN-γ的CTL细胞频数的比较1231.慢乙肝病人体外经IL-2维持生长的T细胞；2.经自体DC刺激后的T细胞；3.DC经Poly（I:C）作用后刺激的T细胞树突状细胞激活的分泌IFN-γ的CTL细胞的频数分布图T：慢性乙型肝炎患者体外经IL-2维持生长的T细胞；DC-T：经树突状细胞刺激后的T细胞；PDC-T：树突状细胞经Poly（I:C）作用后刺激的T细（“━”表示均数）Elispot检测结果说明病人T细胞在经自体树突状细胞刺激后与未刺激前相比，分泌IFN-γ的CTL细胞频数均值由16上升为46，

8、约为2.9倍；发现经Poly（I:C）作用后的树突状细胞所活化的特异性分泌IFN-γ的T细胞频数明显升高，均值为98，和未经树突状细胞刺激组和树突状细胞刺激组相较，分别升高6.1和2.1倍。Tetramer流式细胞技术检测HBVcore18-27特异性CD8+T细胞结果PE-HLA-A0201/HBVc