EF1α启动的高效重组杆状病毒载体的构建及其表达效果-论文.pdf

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1、Re÷=searchPaper：●翟翟蓝西■微生物学报ActaMicrobiologicaSinica54(6)：688—695；4June2014ISSN0001—6209；CN11—1995／Qhttp：／／journals．im．ae．cnZactamicrocndoi：10．13343／j．cnki．wsxb．2014．06．012EFlc~启动的高效重组杆状病毒载体的构建及其表达效果高冬妮，金丽颖，葛菁萍，王昆，安琪，平文祥，楼庄伟微生物黑龙江省高校重点实验室，农业微生物技术教育部工程研究中心，黑龙江大学生命科学学院，黑龙江哈尔滨150080摘

2、要：【目的】通过选用哺乳动物细胞特异性启动子一人类延伸因子1仪启动子(Elonggationfactor1promoter，EF1．仪)、利用病毒假型化工具一截断型水疱型口膜炎病毒G蛋白(TruncatedVessicularstomatitisvirusproteinG，VSV—GED)、添加转录后调控元件(Woodchuckhepatitisviruspost-transcriptionalregulatoryelement，WPRE)和腺病毒反向重复序列(Invertedterminalrepeats，ITRs)，来提高杆状病毒的转导效率及外源基因

3、的表达水平。【方法】从pFB．VSV—GED—WPRE出发构建含EF1Ot启动子的2个重组杆状病毒转移载体pWK和pWK。ITR。再以增强型绿色荧光蛋白(EnhancedGreenFluorescentProtein，eGFP)基因为报告基因插入EF1启动子的下游，构建重组转移载体pWK—eGFP和pWK—ITR-eGFP以及阴性对照pWK(一)-eGFP。将构建好的重组质粒转染Sf9昆虫细胞获得重组杆状病毒，侵染少突神经胶质细胞(OL细胞)后，利用倒置荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达情况。【结果】含有WPRE和ITRs的病毒BV—WK—eGFP、BV—

4、WK—ITR．eGFP荧光表达率明显高于阴性对照，且ITRs能够有效延长eGFP的表达时间，比对照组BV—WK(一)．eGFP延长了72h。经VSV—GED假型化的杆状病毒BV—WK—eGFP、BV—WK-ITR—eGFP转导OL细胞的时间明显缩短，比阴性对照BV—WK(一)一eGFP减少了24h，并且转导效率分别高出阴性对照25．7％与36．5％。【结论】实验证明了VSV．GED能够有效提高杆状病毒的转导效率，WPRE能够显著增强外源基因的表达效率，ITRs延长外源基因的表达时间。为探究改进型重组杆状病毒在脊椎动物细胞表达外源基因及新型重组活载体疫苗的

5、研发奠定了基础。关键词：杆状病毒，VSV—GED病毒假型化，土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件，腺伴随病毒末端反向重复序列，人类延伸因子1Ot(EF1一O／．)启动子中图分类号：Q93．3文章编号：0001—6209(2014)06—0688-08随着分子生物学技术和方法的发展及应用，杆因治疗载体受到人们的高度重视¨。但杆状病毒状病毒已被开发成为高效的真核表达载体系统，用对不同细胞和细胞系的转导效率存在较大差距，从于各种外源基因的表达，并作为一种新型的疫苗、基在人肝癌细胞(HepG2)和仓鼠。肾细胞(BHK)的基金项目：国家自然科学基金(31270143)；黑

6、龙江大学高层次人才(创新团队)支持计划“功能微生物选育及其产物应用”(Hdtd2010—17)黑龙江省科技厅“农业微生物发酵技术”科技创新团队；黑龙江省教育厅科学技术研究项目(12511423)通信作者。Tel：+86451-86608046；Fax：+86451—86609016；E—mail：gejingping@126．corn作者简介：高冬妮(1981一)，女，黑龙江省人，讲师，博士，从事病毒分子生物学研究。E—mail：gaodongni1981@163．tom收稿日期：2013-09-09；修回日期：2013-12—14高冬妮等：EF1仅启动

7、的高效重组杆状病毒载体的构建及其表达效果．／微生物学报(2014)54(6)68995％到某些细胞的5％，尤其是对树突状细胞以及工程有限公司；RNA酶、PCR产物纯化试剂盒购自血来源的细胞系转导效率特别低。此外，杆状Sigma公司；T4DNA连接酶、TaqDNA聚合酶购自病毒介导的外源基因表达量与工业化大生产的要求Fermentas有限公司；质粒抽提、小量胶回收试剂盒有较大差距，并且持续表达的时间较短。这些因素购自华舜生物试剂公司；DMEM培养基购自Hyclone都限制了杆状病毒表达系统的应用。因此，杆状公司；Sf90011SFM、双抗(青霉素．链霉素)

8、、胚胎牛病毒的研究重点就在于将外源基因的表达时间延血清(FetalBovineS