美洲狮和亚洲黑熊蛔虫its序列扩增及序列分析

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1、万方数据中国畜牧兽医2010年第37卷第8期生物技术·41·美洲狮和亚洲黑熊蛔虫ITS序列扩增及序列分析贺现辉1．陈武2，何乐天1一，王培园1，袁子国1。林瑞庆1(1．华南农业大学兽医学院，广州510642；2．广州动物园，广州510070；3．广州创来生物技术有限公司，广州510640)摘要：以采自广州动物园美洲狮和亚洲黑熊体内的蛔虫样品为研究对象，提取样品的总DNA，以保守引物对核糖体DNA内转录间隔区(1TS)序列进行PCR扩增、测序及网上比对。结果表明，美洲狮体内样品获得与GenBank

2、TM公布的狮弓首蛔虫相似性很高的ITS-1、ITS-2和5．8S序列，亚洲黑熊体内样品获得与GenBankTM公布的转移拜林蛔虫相似性很高的ITS-2序列，并首次获得样品的ITS-1与5．8S序列。序列分析结果表明，美洲狮体内蛔虫样品为狮弓首蛔虫，亚洲黑熊体内蛔虫样品为转移拜林蛔虫。关键词：美洲狮；亚洲黑熊；蛔虫；核糖体DNA内转录间隔区；序列分析中图分类号：S852．73文献标识码：A文章编号：1671—7236(2010)08—0041—04蛔虫(ascaris)是一种普遍存在的寄生虫，给生

3、产生活带来了极大危害。辨别蛔虫种类在蛔虫的预防、诊断及治疗方面有着重要作用。传统形态学分类方法简单易行，操作方便，但由于一些蛔虫种类形态相似，难以辨别，特别是虫卵和幼虫阶段，更是难以区分，因此形态学鉴定有局限性。蛔虫核糖体DNA内转录间隔区(internaltranscribedspacer，ITS)序列具有种内保守，种间有一定程度变异的遗传学特点，这为分子分类带来了可能。对ITS序列进行分析，并与基因库里相应序列进行比对，可以为样品的鉴定提供分子生物学证据(林瑞庆等，2005，2008；翁亚彪

4、等，2005；彭仕明等，2008；何光志等，2008)。本试验以从广州动物园美洲狮(PumaCOncol-or)和亚洲黑熊(Uh“sthibetanus)肠道内采集的蛔虫作为研究对象，对其ITS序列进行PCR扩增、测序，并与GenBankrM中蛔虫的相应序列进行比较分析，对样品进行分子鉴定。为蛔虫的分子鉴定提供了科学根据，也为将来同类研究提供借鉴、例证。1材料与方法1．1样品材料样品为采自广州动物园美洲狮和亚洲黑熊肠道内的蛔虫，70％酒精保存，样品编号：收稿日期：2010-03-02作者简介：贺

5、现辉(1983一)，男，河南人，硕士生，主要从事兽医寄生虫学研究。通信作者：林瑞庆(1973一)，男，广东人，副研究员，从事寄生虫分子生物学和遗传学研究。E-mail：rqlin@∞u．edu．crI基金项目：教育部“长江学者和创新团队发展计划”创新团队项目(IRT0723)。Alal、Ala2(美洲狮)；Abal、Aba2(亚洲黑熊)。1．2主要试剂DNA提取试剂盒WizardTMDNACleanUpSystem为Promega公司产品；蛋白酶K为Mereck公司产品；rTaq酶、DNAMar

6、kerDL2000、IPTG和X—gal均为TaKaRa(宝生物工程有限公司)产品；凝胶图像分析系统为英国UVITEC公司产品；BiometraPCR仪为德国Biometra公司产品；Bio-Rad电泳系统为美国Bio-Rad公司产品；DNA胶回收试剂盒为上海生工产品；感受态细胞JMl09为华南农业大学兽医寄生虫学研究室保存。1．3蛔虫DNA提取将虫体样品Alal、Ala2、Abal、Aba2分别放入4个平皿内，反复用双蒸水冲洗，重复4次，吸干水分，取约1cm虫体分别放入1．5mL消过毒的新离心

7、管内。加入包括蛋白酶K在内的消化液，在55℃温度下消化16h。然后按WizardTMDNAClean—UpSystem试剂盒使用说明进行虫体DNA的提取。1．4PCR过程PCR扩增所用引物为NC5：5’一GTAGGTGAACCTGCGGAAGGATT一37；NC2：5’一TTAGTTTCTTCCTCCGCT-3’(上海生工生物技术有限公司合成)，扩增体系为25肛L。PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃变性30S，50℃退火30S，72℃延伸1min，循环32次；最后72℃延伸5min，扩

8、增时设阴性对照。扩增结束后用琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果，于紫外成像系统下观察并记录结果。1．5PCR产物纯化、克隆及筛选用DNA胶回收试剂盒对所得PCR产物进行纯化，纯化后把产物连接到pGEM—TEasy载体上，将连接后载体转化到万方数据·42·生物技术中国畜牧兽医2010年第37卷第8期JMl09感受态细胞中。在含氨苄青霉素和IPTG的LB固体培养基上培养过夜，然后挑选白色菌落，对菌落进行PCR鉴定，筛选出含有目的序列的阳性克隆。1．6测序及分析将Alal、Ala2、Abal、Aba2样品的阳